Flavoglycans：西部红柏树皮中原花青素-多糖共价连接的证据

《Journal of Agricultural and Food Chemistry》：Flavoglycans: Evidence for Covalent Proanthocyanidin–Polysaccharide Linkages in Western Redcedar Bark

　　

研究人员研究了西部红柏树皮（Thuja plicata Donn）中原花青素（PAs）与细胞壁多糖之间的共价连接；该树皮是一种富含单宁的林业副产物，具有作为功能性食品配料的潜力。从水提物中回收的醇不溶性残渣（AIR；占绝干树皮的1.0% w/w）同时含有PAs（≥1.46% w/w of AIR）和多糖（约30% w/w of AIR），并且抵抗惰性溶剂的分级分离，这与顽固的PA-碳水化合物结合一致。酸性丁醇水解结合LC–MS揭示了诊断性C-糖基化花色素，包括6-C-戊糖基花青素、8-C-(脱氧己糖基)花青素和X-C-(脱氧己糖基)-Y-C-戊糖基飞燕草素。核磁共振（NMR）分析支持PA-多糖缀合物的存在，表明半纤维素和果胶是碳水化合物伙伴。这些“flavoglycans”为树皮基质中单宁提取不完全提供了化学基础，并表明碳水化合物缀合可调节PA在水性体系中的可及性和界面相互作用，这与从树皮基质中回收生物活性物质相关。总体而言，本研究提供了汇聚的实验证据线索，支持原花青素与树皮中碳水化合物之间存在C-糖基交联。

论文解读

论文发表于《Journal of Agricultural and Food Chemistry》。研究背景方面，植物细胞壁由纤维素、半纤维素、果胶多糖、糖蛋白及多种多芳香族结构组成，但多酚在细胞壁基质中交联的程度和机制仍不完全清楚。既往对原花青素（PAs，即缩合单宁）与植物细胞壁的研究多集中于非共价相互作用，例如在苹果细胞壁材料和体外纯化多糖体系中已证实此类作用，而PAs与细胞壁多糖之间的共价交联报道较少且认识不足。已知原花青素可通过B环儿茶酚氧化为醌或半醌后与亲核基团反应，或通过A环亲核进攻活化羰基化合物形成共价键，但原花青素多糖共价结构的确切性质仍是植物多酚化学中的未解问题。早在1985年，Porter等人从榅梓果实及云杉和松树树皮中分离出原花青素O-β-吡喃葡萄糖苷，提出糖基化可能是原花青素与细胞壁结合的一种机制；Neilson等人从红树林叶片中分离出原花青素糖缀合物（flavoglycans），为高分子量多糖与黄烷-3-醇聚合物之间的共价连接提供了证据。相比之下，单C-糖基化原花青素仅以痕量（ppm级）被报道。西部红柏树皮水提物同时含有原花青素和多糖，其共存长期阻碍提取物利用。前期研究中，醇不溶性残渣（AIR）中的多糖与原花青素难以分离，提示可能存在共价连接。由于硫解法无法鉴定O-或C-糖基化单元，且回收率低，研究人员转而采用酸性丁醇水解法，因为该方法对共价修饰的原花青素，特别是糖基化种类，具有更好的解聚效果，并且C-糖苷在酸性条件下稳定，便于通过LC–MS识别。本研究旨在通过酸性丁醇水解产物的LC–MS和NMR分析，研究原花青素通过C-糖基化与多糖链共价连接的可能性，并提出首个初步的flavoglycan结构模型。

研究人员用于开展研究的关键技术方法包括：以西部红柏树皮为原料，样品来自加拿大不列颠哥伦比亚省Teal Jones Group锯木厂，原料采自Terrace地区；通过水提和有机溶剂洗涤制备醇不溶性残渣（AIR）；采用酸性丁醇水解使原花青素解聚为花色素类产物；结合液相色谱-质谱联用（LC–MS）及串联质谱鉴定C-糖基化花色素；利用核磁共振波谱（NMR，包括¹H、¹H–¹³C HSQC、HSQC-TOCSY、COSY和HMBC）对解聚产物进行结构验证；设置黄烷-3-醇与碳水化合物的模型混合物进行酸性丁醇水解，以排除C-糖苷原位形成的人为假象；并通过Amberlite XAD7HP、PVPP-Silica Gel和Sephadex LH-20等色谱步骤富集目标组分。

结果部分：

3.1 从AIR中分离和检测C-糖基化花色素。酸性丁醇水解模型混合物仅产生预期的花青素，未检测到原花青素或花青素与单糖的缩合产物，说明水解后观察到的糖基化种类来自AIR中的天然结构，而非反应人为产物。除预期花青素外，还检测到丁氧基化花青素，但未与目标花色素共洗脱，不干扰鉴定。对AIR水解物的固相萃取得到富含花色素的F1级分和聚合反应产物F2级分。

3.1.1 质谱鉴定花色素与苷元。通过与标准品比较，在F1中鉴定出花青素、天竺葵素和芍药素，飞燕草素仅在粗水解物中检测到。芍药素的检出提示部分原花青素B环发生甲基化，这与细胞壁结合型黄酮的常见修饰一致。三种C-糖基化花色素被鉴定：8-C-(脱氧己糖基)花青素、6-C-戊糖基花青素以及X-C-(脱氧己糖基)-Y-C-戊糖基飞燕草素（查尔酮形式）。质谱碎片特征排除了O-糖基化可能，并表明糖基通过酸稳定的C-糖苷键连接。

3.1.2 解聚WRC树皮AIR的NMR分析。NMR谱图显示黄鎓环C4–H质子、A/B环芳香质子及碳水化合物衍生质子信号。HSQC谱中δ_H 4.5–5/δ_C 70–85 ppm的交叉峰与芳香族C-糖苷中异头质子特征一致；HMBC谱中δ_H 4.7/δ_C约161和约170 ppm的相关峰分别提示糖异头质子与黄鎓A环C5和C7之间存在长程耦合。NMR数据不能精确定位C-糖基化位置，但支持LC–MS推断的低丰度酸稳定性C-糖基化花色素的存在。

3.2 WRC树皮flavoglycans的结构模型。基于质谱和NMR证据，研究人员提出初步结构模型：不同链长的多糖通过酸稳定的C-糖苷键与原花青素共价连接，三种C-糖基化花色素被认为是flavoglycan中的链间连接残基。戊糖和脱氧己糖的检出表明木聚糖、阿拉伯聚糖等半纤维素及鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I等果胶参与了共价连接。定量估计显示，三种C-糖基化花色素总量约0.8 nmol花青素当量/g AIR，对应约64 μmol链间连接/100 mol单糖单元或约2 mmol连接/100 mol黄烷-3-醇单元，且该值是最低估计。

3.3 flavoglycan分析的局限与挑战。由于植物提取物固有复杂性、目标物痕量丰度、缺乏完整flavoglycan大分子分离方法及仪器灵敏度限制，结构确证仍有困难。低丰度C-糖基化花色素、氧化原花青素抗酸解聚、水解副反应及聚合色素干扰使LC–MS和NMR解析复杂化。缺乏C-糖基化黄烷-3-醇和花色素标准品也限制鉴定与定量，因此NMR归属应视为初步性，结构模型需更多正交分析方法确证。

讨论与结论部分指出，尽管flavoglycan的精确性质和生物功能尚未完全阐明，但C-糖基化可能赋予其比O-糖基化更强的抗酸和抗酶解稳定性；多糖部分的高度亲水性即使仅有一条共价连接链也可能显著改变糖缀合物在水性体系中的溶解性、流体力学尺寸、界面行为及抗解聚能力，并可能影响膳食纤维的吸水、溶胀和结肠微生物利用等特性。研究表明，西部红柏树皮中原花青素与细胞壁多糖确实可通过C-糖基化共价连接，这为树皮提取物中两类组分难以分离提供了化学基础。研究结论为：结合LC–MS和NMR对酸性丁醇水解产物的分析揭示了C-糖基化花色素的存在，为西部红柏树皮AIR中C-糖基化原花青素的存在提供了实验证据；基于这些发现，研究人员提出初步flavoglycan结构模型，即原花青素与细胞壁多糖通过C-糖苷键及非共价相互作用结合。从应用角度看，西部红柏树皮的价值化策略应同时考虑可自由提取或非共价结合的组分以及共价结合的flavoglycan；其水可提取性有利于引入食品体系，对其结构、稳定性和界面性质的深入理解有望推动其在食品、农业、营养及生物基技术领域的应用。