雌激素剥夺通过神经元CTSS信号加剧阿尔茨海默病病理

《Journal of Neuroinflammation》：Estrogen deprivation exacerbates Alzheimer’s disease pathology through neuronal CTSS signaling

　　

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）表现出显著的性别偏倚，女性面临不成比例的高风险和更严重的病理。绝经后雌激素下降与该易感性有关，但将雌激素丢失与AD发病机制联系起来的分子机制仍不完全清楚。本研究表明，雌性5xFAD小鼠的卵巢切除术（ovariectomy, OVX）显著加剧了淀粉样蛋白-β（amyloid-β, Aβ）病理、认知缺陷、神经炎症，并减少了突触标志物。雌激素受体信号的药理学阻断重现了这些效应，证实其依赖于雌激素受体通路。单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq）揭示了雌激素剥夺后跨脑细胞类型的广泛转录重编程，其中溶酶体蛋白酶组织蛋白酶S（cathepsin S, Ctss）和AD风险基因ApoE显著上调。值得注意的是，CTSS的部分基因敲低阻止了OVX诱导的雌性5xFAD小鼠Aβ积累、胶质细胞活化和突触衰退，确立了CTSS作为雌激素缺乏驱动病理的关键下游介质。研究结果为性别偏倚的AD易感性提供了机制性见解，并确定CTSS是减轻绝经后女性AD风险的有前景的治疗靶点。

雌激素剥夺通过神经元CTSS信号加剧阿尔茨海默病病理的机制研究

一、研究背景与科学问题

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种以Aβ斑块进行性积累、神经原纤维缠结和显著神经炎症为特征的毁灭性神经退行性疾病，最终导致突触丢失和认知衰退。流行病学数据显示，AD具有显著性别偏倚，女性占患者总数近三分之二，即使在校正了较长平均寿命后，这一差异依然存在。越来越多的证据提示，与绝经相关的卵巢激素下降，尤其是17β-雌二醇（17β-estradiol, E2）的减少，是女性迟发性AD的关键生物学催化剂。雌激素通过其受体ERα和ERβ发挥多重神经保护作用，包括维持突触可塑性和调节Aβ代谢。此外，雌激素还是强效的免疫调节因子，在健康脑中维持小胶质细胞稳态并抑制促炎转录程序。然而，将激素丢失转化为慢性神经炎症状态的具体分子桥梁，以及这些效应是否由细胞类型特异性信号驱动，仍不完全清楚。

近年来，单核转录组学进展凸显了内溶酶体-蛋白水解系统失调是AD的核心驱动因素。其中，CTSS作为一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，已成为关键候选分子。尽管CTSS主要参与抗原呈递，神经元来源的CTSS可分泌至细胞外空间，切割趋化因子CX3CL1，从而触发CX3CR1依赖性小胶质细胞募集和活化。尽管CTSS已被涉及Aβ加工和突触修剪，但其在性别特异性AD易感性中的作用尚未被探索。研究人员假设CTSS可能是雌激素耗竭与随后观察到的女性神经炎症激增之间的缺失环节。

二、研究内容与主要发现

为验证上述假设，研究人员利用去卵巢5xFAD小鼠模拟绝经后雌激素剥夺，系统评估其对AD进展的影响。研究首先证实OVX显著降低血清E2水平，并加速体重增长，阴道涂片显示OVX小鼠处于持续动情间期状态，确认了雌激素缺乏状态的成功建立。行为学测试显示，OVX小鼠在旷场实验中中心区域停留时间和距离减少，Y迷宫自发交替率显著下降，情境恐惧记忆受损，Morris水迷宫目标象限停留时间缩短，表明雌激素剥夺显著加剧了5xFAD小鼠的认知缺陷和焦虑样行为。

在病理层面，X34染色显示OVX小鼠海马和皮层淀粉样斑块负荷显著增加，单分子检测证实可溶性和不溶性Aβ40及Aβ42水平均显著升高。值得注意的是，OVX并未改变APP表达及其加工过程，包括α-CTF和β-CTF水平以及App、Bace1/2、Psen1/2的表达，提示雌激素缺乏加剧Aβ病理并非通过促进淀粉样蛋白生成途径。慢性给予雌激素受体拮抗剂他莫昔芬或氟维司群同样显著增加斑块负荷，证实该效应依赖于雌激素受体信号通路。

免疫荧光和蛋白质印迹分析显示，OVX小鼠海马和皮层IBA1阳性小胶质细胞面积和GFAP阳性星形胶质细胞面积均显著增加，斑块相关小胶质细胞数量增多，CD68阳性活化小胶质细胞比例升高，同时LAMP1阳性营养不良性神经突增加，表明雌激素剥夺加剧了淀粉样蛋白相关的神经炎症和溶酶体功能障碍。此外，OVX小鼠海马PSD95/Bassoon共定位突触斑块密度显著降低，PSD95和突触素（synaptophysin, SYP）蛋白水平下降，为认知缺陷提供了结构基础。

为阐明机制，研究人员对原代小胶质细胞进行E2处理并进行bulk RNA测序，鉴定出239个差异表达基因，KEGG富集分析显示这些基因主要富集于吞噬体、胞葬作用、免疫信号通路和代谢通路。E2处理上调了包括Eea1、Scarb1、Calr和Fcgr1在内的多个关键吞噬相关基因，pHrodo吞噬实验功能验证了E2显著增强小胶质细胞吞噬能力。

单核RNA测序（snRNA-seq）分析海马组织，鉴定出15个转录上不同的亚群，涵盖神经元、少突胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质前体细胞和星形胶质细胞五大类群。OVX小鼠中疾病相关小胶质细胞（disease-associated microglia, DAM）群体显著扩增。差异表达分析显示兴奋性神经元呈现最深刻的转录变化，514个基因上调和1807个基因下调，GO富集分析揭示上调基因显著富集于突触组织与调控、树突形态发生、突触囊泡循环和认知相关通路。此外，OVX小鼠神经元中ApoE表达显著上调，并通过免疫荧光和蛋白质印迹在蛋白水平得到验证。

三、关键技术方法

研究人员主要运用以下关键技术：采用双侧卵巢切除术（OVX）构建雌激素剥夺模型，并结合雌激素受体拮抗剂药理学干预；利用5xFAD转基因AD小鼠模型，并通过与Ctss基因敲除小鼠杂交构建5xFAD;Ctss?/?杂合敲除小鼠；运用单核RNA测序（snRNA-seq）和bulk RNA测序进行转录组分析；采用行为学测试（旷场、Y迷宫、恐惧条件化、Morris水迷宫）评估认知功能；结合免疫荧光、X34淀粉样斑块染色、蛋白质印迹和单分子Aβ检测系统进行病理学评估。原代小胶质细胞培养及pHrodo吞噬实验用于功能验证。所有小鼠均来自Jackson Laboratory和Cyagen Guangzhou Biosciences。

四、研究结果

OVX加剧雌性5xFAD小鼠认知缺陷：通过OVX手术建立雌激素剥夺模型，行为学测试证实OVX小鼠出现空间工作记忆、情境记忆和空间参考记忆损害，同时伴有焦虑样行为增加。

OVX和雌激素信号药理学阻断加重雌性5xFAD小鼠淀粉样蛋白-β病理：X34染色和单分子检测证实OVX增加海马和皮层斑块负荷及Aβ40/Aβ42水平，雌激素受体拮抗剂重现该效应，且不依赖于APP表达或加工的改变。

OVX加剧雌性5xFAD小鼠神经炎症和溶酶体功能障碍：免疫荧光和蛋白质印迹显示OVX增加小胶质细胞和星形胶质细胞活化、斑块相关小胶质细胞数量、CD68阳性细胞比例及LAMP1阳性营养不良性神经突。

雌激素剥夺降低雌性5xFAD小鼠突触密度和突触标志物：PSD95/Bassoon共定位斑块密度及PSD95和SYP蛋白水平在OVX后显著下降。

雌二醇处理改变原代小胶质细胞转录组谱并增强吞噬能力：bulk RNA测序和pHrodo实验证实E2上调吞噬相关基因表达并增强小胶质细胞吞噬功能。

单核转录组学揭示雌激素剥夺响应的细胞类型特异性转录重编程：snRNA-seq鉴定出广泛的转录变化，兴奋性神经元变化最为显著，DAM群体扩增，ApoE在神经元中上调。

Ctss部分基因敲低逆转OVX诱导的雌性5xFAD小鼠Aβ病理加剧：5xFAD;Ctss?/?-OVX小鼠斑块负荷、斑块大小和斑块数量均与5xFAD;Ctss?/?-SHAM无显著差异，证明CTSS减少阻止了OVX诱导的Aβ积累。

Ctss基因敲低阻止OVX诱导的雌性5xFAD小鼠神经炎症和溶酶体功能障碍：CTSS部分缺失降低LAMP1、IBA1和GFAP面积，且OVX不再增加这些指标。

Ctss基因敲低保护雌性5xFAD小鼠免受OVX诱导的突触和认知损伤：CTSS部分缺失增加突触标志物水平，且OVX不再引起突触密度下降和行为缺陷。

五、讨论与结论

本研究首次定义了雌激素-神经元CTSS-小胶质细胞信号轴，为女性偏倚的AD易感性提供了机制框架。研究发现OVX通过雌激素受体依赖性机制加剧Aβ病理、神经炎症和突触衰退，而CTSS的部分基因敲低可有效逆转这些病理变化，确立CTSS作为雌激素缺乏驱动病理的关键下游介质。研究还揭示了E2通过增强小胶质细胞吞噬能力促进Aβ清除的机制。这些发现不仅阐明了绝经后雌激素下降与AD风险增加之间的分子联系，还确定了CTSS作为减轻绝经后女性AD风险的有前景的治疗靶点，为性别特异性AD干预策略的开发提供了重要理论依据。该研究发表在《Journal of Neuroinflammation》。