LY6E通过损害病毒内化调控伪狂犬病病毒早期感染

《Veterinary Research》：LY6E regulates Pseudorabies virus early infection via impairing viral internalization

　　

伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）引起奥耶斯基氏病，对畜牧业构成新兴威胁，并引起对人类健康的关注。宿主细胞利用多种内在因子抵抗病毒感染；然而，参与限制PRV进入的宿主因子仍知之甚少。在本研究中，研究人员利用人和猪细胞模型，鉴定出LY6E（淋巴细胞抗原6家族成员E）在抑制PRV感染中具有强效抗病毒作用。LY6E过表达显著降低PRV感染，而LY6E缺失则增加感染，支持其针对PRV的良好抗病毒作用。结构与功能分析确定，LY6E的正确结构对其完全抗病毒活性不可或缺。转录组学分析揭示，LY6E在PRV感染期间调节特定宿主信号通路，而不引发全局转录改变。此外，发现LY6E与PRV囊膜糖蛋白相互作用，暗示其在调节病毒进入中的作用。后续研究表明，LY6E不干扰PRV与宿主细胞的初始附着，而是特异性损害病毒内化。总之，本研究将LY6E鉴定为一种此前未被识别的PRV宿主限制因子，并强调表面蛋白在控制病毒进入中的作用。此外，它将LY6E的抗病毒谱扩展至DNA病毒，超越其此前报道的与RNA病毒的宿主-病毒相互作用。

**LY6E通过损害病毒内化调控伪狂犬病病毒早期感染——论文解读**

伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）是引起奥耶斯基氏病的α疱疹病毒，感染宿主范围广泛，近年来不断有跨种传播至人类的报道，对畜牧业造成重大经济损失，同时也构成公共卫生威胁。宿主细胞可表达多种内在抗病毒因子，在病毒复制周期的不同阶段发挥防御功能，其中调控病毒进入的蛋白是抗病毒第一道防线的重要组成部分。病毒进入是一个涉及附着、内化、膜融合和脱壳的复杂多步骤过程，宿主因子对这些早期事件的调节可影响病毒嗜性、复制效率及感染结局。尽管干扰素（Interferon, IFN）诱导的基因在抗病毒免疫中作用关键，但许多内在限制因子并不依赖IFN信号直接控制病毒感染。淋巴细胞抗原6家族成员E（Lymphocyte antigen 6, family member E, LY6E）是近年来被关注的宿主-病毒互作调控因子，其在RNA病毒（如HIV-1、流感病毒、黄病毒）感染中表现出促进或限制病毒感染的 dual 作用。然而，LY6E是否参与限制DNA病毒（如PRV）的进入，此前尚不清楚。基于此，研究人员提出假设：LY6E可能通过干扰PRV复制周期的进入事件来限制其感染。

为验证这一假设，研究人员利用多种人源和猪源细胞模型，包括人胚肾HEK293T细胞、人肺腺癌A549细胞、猪肾PK-15细胞及猪血管内皮细胞（Porcine vascular endothelial cells, PVEC），通过过表达和siRNA介导的敲低实验，结合PRV-GFP报告病毒，系统评估了LY6E对PRV感染的影响。研究中采用了免疫印迹、RT-qPCR、TCID₅₀病毒滴定、免疫荧光、共聚焦显微镜、RNA测序（RNA-seq）、免疫共沉淀以及基于温度转换的病毒附着和内化实验等技术。其中，RNA-seq数据来自HEK293T细胞转染空载体或LY6E质粒后感染或不感染PRV的样本，三个生物学重复，数据已提交至NCBI SRA数据库（登录号PRJNA1461001）。附着和内化实验通过4℃条件下允许病毒结合但不内化、随后升至37℃促进内化的步骤，将两个过程功能分离。

研究结果分为以下几个部分。第一，**LY6E在多种细胞类型中对PRV具有广谱抗病毒作用**。在HEK293T、A549、PK-15和PVEC细胞中，过表达LY6E均显著降低PRV-gB蛋白水平和病毒滴度，且呈剂量和时间依赖性；siRNA敲低LY6E则增强PRV感染。此外，LY6E过表达也能抑制单纯疱疹病毒1型（Herpes simplex virus type 1, HSV-1）感染，提示其抗病毒作用可能扩展至α疱疹病毒亚科。第二，**关键残基L36和N99的位点特异性突变并不显著损害LY6E介导的抗病毒限制**。与冠状病毒系统中LY6E依赖L36和N99残基促进病毒融合的模式不同，L36A/N99A双突变体仍能有效抑制PRV-gB表达和病毒产量，说明这两个残基对于PRV限制并非必需。第三，**LY6E的胞外/LU结构域和C端区域对其抗PRV活性均有贡献**。分别缺失C端（Mut-1）或胞外/LU结构域（Mut-2）后，LY6E抗病毒活性部分丧失，但仍保留一定抑制能力，表明两个结构域协同作用以实现完全抗病毒功能。第四，**LY6E表达细胞的PRV感染转录组分析**显示，LY6E本身对未感染细胞的转录组影响极小，在PRV感染背景下也未引发全局转录变化，而是选择性调节特定宿主通路，包括核糖体生物发生、rRNA加工、内质网应激反应、MHC I类抗原呈递以及凋亡信号调控等。第五，**LY6E通过与PRV糖蛋白相互作用损害病毒内化**。免疫共沉淀实验显示，LY6E可与PRV囊膜糖蛋白gB、gK和gM形成复合物，并在感染条件下与gB共沉淀。温度转换实验表明，LY6E不干扰PRV在4℃下的附着，但显著减少37℃下内化的病毒基因组拷贝数，证明LY6E特异性抑制附着后的内化步骤。

在讨论部分，研究人员指出，LY6E此前在RNA病毒中被报道为促病毒因子，而本研究首次明确其在DNA病毒PRV感染中作为限制因子发挥作用，扩展了LY6E的抗病毒谱。与冠状病毒系统中L36和N99残基的关键作用不同，PRV限制并不严格依赖这些残基，提示不同病毒系统中LY6E的结构-功能机制存在差异。转录组分析进一步支持LY6E作为膜相关调节因子，通过重塑宿主细胞环境（如内质网应激和抗原呈递通路）间接影响病毒感染，而非直接抑制病毒基因转录。LY6E与糖蛋白的互作以及内化抑制现象，说明其作用靶点为病毒进入的早期事件，但具体亚细胞定位尚需深入研究。

结论部分总结：本研究确立了LY6E作为抑制PRV感染的宿主因子，其通过损害附着后进入阶段发挥作用，并鉴定了参与该过程的病毒结构组分。LY6E通过重塑宿主细胞过程来限制病毒进入和早期感染，为疱疹病毒家族中基于进入的抗病毒机制提供了新见解。未来研究可进一步探索IFN介导的LY6E调控以及体内验证，为控制病毒性疾病提供科学基础。