热休克蛋白HSP70与硫化氢供体对多种变应原激活THP-1细胞的影响

《Molecular Biology》：Effect of HSP70 and Hydrogen Sulfide Donor on Activation of THP-1 Cells by Various Allergens

　　

尘螨（HDM）是室内变应原的常见来源，参与过敏性哮喘的发病机制。HDM所含的变应原可与多种病原体相关分子结构结合，包括脂多糖（LPS）和β-葡聚糖。HDM变应原激活TLR4依赖性巨噬细胞信号通路，导致活性氧（ROS）产生增加以及促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α（TNFα）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）的过度释放。研究人员测试了重组人热休克蛋白HSP70和快速硫化氢供体硫代硫酸钠（STS）对人THP-1细胞内信号传导的抗炎作用，并与随后加入的HDM提取物和β-葡聚糖联合处理。研究表明，HSP70和STS能显著降低HDM和β-葡聚糖诱导的人THP-1前单核细胞中ROS、TNFα、IL-1β和IL-6的产生，并降低TLR2和TLR4细胞受体的水平。此外，还发现HSP70和STS能够恢复细胞内的谷胱甘肽水平。研究证明，细胞受体、细胞内信号转导途径和内吞机制在STS和外源性HSP70保护THP-1细胞免受HDM和β-葡聚糖影响的机制中发挥重要作用。涉及p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和核因子κB（NF-κB）的信号通路被发现在这些保护机制中起关键作用。

论文解读：HSP70与硫化氢供体对变应原激活THP-1细胞的保护作用及其机制

研究背景与研究目的

过敏性哮喘是一种异质性气道炎症性疾病，其病理机制涉及免疫细胞与气道上皮结构细胞之间的复杂相互作用。屋尘螨（HDM）是室内最常见的变应原来源之一，全球约5亿人受HDM过敏影响，占全球人口的4%-6%。HDM变应原可结合多种病原体相关分子模式，包括脂多糖（LPS）、几丁质和β-葡聚糖等。这些成分通过激活先天免疫细胞上的Toll样受体（TLR），特别是TLR4和TLR2，触发下游信号级联反应，导致活性氧（ROS）大量产生以及促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α（TNFα）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）的过度释放，从而加剧气道炎症和组织重塑。

尽管已有多种抗炎药物用于哮喘治疗，但针对TLR4过度激活的靶向治疗策略仍在积极探索中。热休克蛋白70（HSP70）作为一种内源性应激蛋白，已被证实具有抗炎和细胞保护功能。同时，气体信号分子硫化氢（H₂S）及其供体也展现出显著的抗炎和抗氧化潜力。然而，这两种物质在HDM和β-葡聚糖诱导的炎症模型中的比较性研究尚不充分。因此，本研究旨在系统比较重组人HSP70与快速H₂S供体硫代硫酸钠（STS）对人THP-1前单核细胞分化的巨噬细胞在LPS、HDM和β-葡聚糖刺激下的保护效果，并深入探讨其潜在的分子机制。该研究成果发表于《Molecular Biology》。

主要技术方法

研究人员采用人THP-1前单核细胞系，经佛波酯（PMA）诱导分化为巨噬细胞样细胞。主要关键技术包括：使用硝基蓝四氮唑（NBT）还原法检测细胞内ROS产生水平；基于L-929小鼠成纤维细胞毒性实验测定TNFα产量；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）定量检测IL-1β和IL-6分泌量；运用流式细胞术结合特异性抗体评估细胞膜表面TLR2和TLR4的表达水平；利用ThiolTracker? Violet荧光探针检测还原型谷胱甘肽（GSH）含量；并通过特异性信号通路抑制剂（包括SB203580抑制p38MAPK、PD98059抑制ERK1、SP600125抑制JNK、U0126抑制ERK1/2、U73122抑制PLC、wortmannin抑制PI3K、BAY 11-7082抑制NF-κB）及甲基-β-环糊精（MBCD）破坏脂筏结构，探究HSP70和STS保护作用的信号转导机制。

研究结果

1. HSP70和硫化氢供体STS降低LPS、β-葡聚糖和HDM诱导的THP-1细胞ROS和TNFα产生

研究发现，LPS和HDM对细胞的激活作用最强，β-葡聚糖单独作用较弱。HSP70可将LPS、HDM、β-葡聚糖单独或联合LPS诱导的ROS产量降低不超过50%，而STS的抑制作用更强，降低幅度超过60%。在TNFα方面，HSP70预处理使上述刺激物诱导的TNFα产量降低超过60%，STS则降低47%-71%。结果表明两者均能有效减轻炎症反应。

2. HSP70、STS、HDM、β-葡聚糖和LPS对THP-1细胞TLR2和TLR4水平的影响

流式细胞术检测显示，LPS、HDM和β-葡聚糖均显著提高细胞膜上TLR2和TLR4的中位荧光强度（MFI）。HSP70和STS预处理后，这些受体的上调水平明显下降，表明降低TLR2和TLR4表达是其保护机制之一。

3. HSP70和STS减少暴露于LPS、β-葡聚糖和HDM的THP-1细胞中IL-1β和IL-6的分泌

HSP70使LPS诱导的IL-1β和IL-6分别降低26%和51%，并使HDM、β-葡聚糖及其联合诱导的IL-1β降低超过45%。STS则使各刺激组IL-1β分泌降低超过50%，并使IL-6分泌降低33%-60%。这表明两种物质能有效抑制促炎细胞因子的释放。

4. HSP70和STS恢复正常化LPS或HDM处理后THP-1细胞中降低的还原型谷胱甘肽水平

LPS和HDM显著降低了细胞内GSH水平，提示氧化应激的发生。HSP70和STS预处理能将GSH水平恢复至接近对照组水平，β-葡聚糖对GSH水平几乎无影响。

5. 在信号通路抑制剂存在下HSP70和STS对HDM和β-葡聚糖激活THP-1细胞的保护效率

通过计算保护效率（F值）发现，p38MAPK抑制剂SB203580、PI3K抑制剂wortmannin和NF-κB抑制剂BAY 11-7082对HSP70和STS的保护效果削弱最为显著。此外，MBCD破坏脂筏结构后，HSP70和STS对HDM和β-葡聚糖诱导的ROS产生的保护效率也大幅降低，提示脂筏完整性在这些保护机制中至关重要。

讨论与结论

综合所有实验结果，研究人员得出结论：HSP70和STS通过多重机制发挥保护作用。首先，它们能降低细胞膜上TLR2和TLR4的表达水平，从而减少变应原与受体的结合及后续信号激活。其次，两者能够恢复由氧化应激耗竭的GSH水平，增强细胞的抗氧化防御能力。第三，信号通路抑制剂实验揭示，p38MAPK、PI3K和NF-κB信号通路在HSP70和STS的保护机制中扮演核心角色。此外，脂筏结构的完整性对于这些保护作用的发挥同样不可或缺，因为TLR受体及NADPH氧化酶均定位于脂筏区域。

值得注意的是，STS在某些指标上的保护效果略优于HSP70。转录组学分析进一步支持了这些发现，表明H₂S供体可通过调节多种信号分子（如IRF9、STAT3、CD40等）的表达来抑制炎症反应。总之，本研究系统阐明了HSP70和STS通过调控TLR受体表达、恢复谷胱甘肽水平以及干预p38MAPK/PI3K/NF-κB信号通路，有效保护THP-1细胞免受HDM和β-葡聚糖诱导的炎症损伤，为开发新型抗过敏哮喘治疗策略提供了重要的理论基础。