《Transgenic Research》：Abstracts of the 20th Transgenic Technology Meeting (TT2026)
摘要：第20届转基因技术会议（TT2026）汇集了转基因研究领域的前沿进展，涵盖口头报告（Oral Presentations）与海报展示（Poster Presentations）两大板块。会议聚焦于基因编辑新技术、3Rs原则（替代、减少、优化）的实践应用、疾病模型构建及非小鼠物种的转基因研究。口头报告部分涉及整合酶（integrase）介导的大片段DNA高效整合、亚透明带（sub-zona）显微注射与电穿孔结合的CRISPR递送策略、重组腺相关病毒（rAAV）介导敲入等位基因的隐藏结构复杂性解析、细胞穿透肽（CPP）介导的胚胎基因编辑、CRISPR-SWITCH策略实现单等位基因靶向编辑、冷冻种质与交配栓的基因分型质控、刺毛鼠（Acomys dimidiatus）基因组编辑平台开发、猪安全港位点（V2G locus）的连续转基因、阿尔茨海默病嵌合小鼠模型构建、线粒体碱基编辑治疗Leber遗传性视神经病变（LHON）、合子先导编辑（prime editing）验证多发性硬化候选基因、转基因兔国家中心建设、水牛热耐受性基因编辑胚胎生产、Whitten效应优化体外受精（IVF）、AAV供体DNA介导的细胞系敲入、纳米孔测序（ONT）与DAJIN2分析提升基因修饰小鼠生产效率、Pythia深度学习框架辅助微同源臂设计、Cas12靶向多重纳米孔测序（CTM-nSeq）、交叉遗传策略靶向特定免疫细胞群、dCas9与Cas9联合编辑策略、mTmG统一报告系统等。海报展示涵盖条件性反转（COIN）策略、荧光报告基因作为rAAV包装填充序列、牛诱导多能干细胞（iPSC）向卵母细胞样细胞分化、成年小鼠耳夹成纤维细胞（FAME）作为遗传材料来源、重组酶介导切除等位基因（delta allele）的基因分型陷阱、Emilin-1在外周神经中的作用、猪主动脉内皮细胞分离与功能扩增、短条件性内含子（SCON）条件性敲除、ssODN方向性与同源定向修复（HDR）效率、GenoCheck遗传变异控制、RAD51/BCCIP增强同源染色体间修复的可重复性评估、CRISPR时代小鼠资源库的机遇与挑战、无扩增多重HiFi长读长测序验证、冷冻精子经宫颈人工授精评估等研究。会议全面展示了转基因技术从工具开发、模型构建到临床转化应用的完整创新链条，强调了3Rs原则在减少动物使用、优化实验设计中的核心作用。
第20届转基因技术会议（TT2026）研究进展解读
一、研究背景与意义
转基因技术是生命科学研究中不可或缺的核心工具，尤其在构建人类疾病动物模型、解析基因功能以及推动再生医学和异种移植等转化研究领域发挥着关键作用。近年来，以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术极大地加速了基因修饰动物模型的构建效率，然而该领域仍面临诸多亟待解决的技术瓶颈。首先，大片段DNA（数十至数百千碱基）的定点整合效率低下，传统同源定向修复（HDR）途径在受精卵和多种细胞类型中效率有限，难以满足复杂疾病模型（如非编码区突变、人源化基因座替换）的构建需求。其次，对于与胚胎致死、显性负效突变或 welfare 问题相关的基因，常规CRISPR编辑常导致双等位基因编辑，产生非存活胚胎或出生后早期死亡，严重阻碍了杂合子模型的建立。第三，基因编辑结果的结构复杂性（如供体多联体、部分整合、随机插入及嵌合体等位基因混杂）难以通过传统PCR和Sanger测序准确解析，导致创始人（G0）动物的筛选效率低下，增加了不必要的动物繁育和使用，违背了3Rs原则（替代、减少、优化）。第四，现有递送策略（如显微注射、电穿孔）技术要求高、设备昂贵，且对胚胎发育阶段有特定要求，限制了高通量应用。此外，非小鼠物种（如兔、猪、水牛、刺毛鼠等）的基因编辑平台尚不成熟，制约了具有独特再生能力或更高转化相关性物种的遗传学研究。最后，小鼠资源库中存档品系的遗传背景和等位基因结构常存在不准确或信息缺失问题，严重影响研究可重复性。因此，开发更高效、精准、可扩展且符合3Rs原则的转基因技术，并建立完善的质控和验证体系，是当前该领域的核心任务。
二、研究内容与主要结论
本届会议（TT2026）汇集了多项突破性研究进展，系统性地回应了上述挑战。在新技术开发方面，研究人员评估了Bxb1和Pa01整合酶（serine recombinases）在小鼠胚胎干细胞（ES细胞）中介导大片段DNA（18–178 kb）定点整合的可行性，证实两种整合酶均能高效支持大片段构建体的位点特异性整合，且长读长测序（ONT）确认了整合的准确性和结构完整性，为复杂小鼠模型构建提供了新工具。研究人员还开发了优化的亚透明带（sub-zona）显微注射结合Cas9/sgRNA核糖核蛋白（RNP）电穿孔的工作流程，可在不到一小时内处理多达100个胚胎，无需高度专业化的显微注射技能，显著提高了大片段供体模板的靶向整合效率和活产幼崽产量。在递送技术方面，细胞穿透肽（CPP）TAT-HA2被证实可介导细胞渗透性Cas蛋白进入小鼠合子及晚期植入前胚胎（4细胞、8细胞期），实现超过90%的插入缺失（Indel）率，且不影响囊胚发育率；结合非手术胚胎移植（NSET），实现了无需手术的可靠胚胎编辑和移植，为基因编辑提供了更简便、低成本的方案。
针对致死性基因编辑难题，研究人员提出了CRISPR-SWITCH策略，通过在致病突变上游引入同义沉默突变，并设计针对该修饰等位基因的引导RNA，在杂合胚胎中实现单等位基因向致病突变的定向转换，从而保留野生型等位基因，成功建立了Syt1-D365E和Syt1-I368T杂合子小鼠模型，100%新生小鼠（n=30）呈现单等位基因编辑，为显性负效突变和纯合致死基因的杂合模型构建提供了通用方案。另一项研究探索了dCas9与Cas9联合使用的策略，通过优化dCas9:Cas9比例（80:20为最佳），在编辑致死或welfare相关基因时显著提高了胚胎至幼崽的存活率，增加了野生型等位基因的出现频率，同时在不影响HDR效率的情况下降低了脱靶突变率，并成功解决了旁系同源簇（paralogous clusters）的脱靶问题。此外，研究人员还验证了RAD51和BCCIP增强同源染色体间修复（interhomolog repair）策略在胚胎阶段将杂合子转换为纯合子的可重复性，但结果显示该策略在两种不同插入大小的模型中均未显著提高纯合转换频率，提示该方法的适用性存在局限。
在编辑结果验证方面，LOCK-seq（长读长测序捕获千碱基靶标）技术被应用于表征rAAV介导敲入的创始人动物，揭示了包括精确/不精确敲入、供体多联体、部分整合、随机插入及嵌合体多等位基因等复杂编辑结果，并识别出与最佳F1传递相关的LOCK-seq模式（插入区域读段覆盖平衡、相对于内源位点的比例覆盖降低、无AAV来源序列），为创始人优先筛选和结构验证提供了有力工具。研究人员还开发了Cas12靶向多重纳米孔测序（CTM-nSeq），利用Cas12a产生的粘性末端结合DNA片段大小富集和优化的T7-DNA连接酶介导的接头连接，可在同一DNA样本中并行分析多个位点，支持条形码多重样本分析，适用于验证PCR不兼容的复杂等位基因。另一项研究建立了ONT长读长测序结合DAJIN2等位基因聚类分析软件的流程，将G0筛选时间缩短达50%，并能同时鉴定多种编辑结果（如敲除、错义突变），从同一轮创始人筛选中生成多个有用小鼠品系。此外，无扩增多重HiFi长读长测序（PacBio）被成功应用于验证包括Rosa26安全港位点在内的挑战性基因座，实现了成本效益高的系统化、准确、无偏的靶向编辑检测。
在疾病模型构建方面，研究人员利用高保真DddA衍生胞嘧啶碱基编辑器（Hifi-DdCBE）成功构建了携带人LHON致病突变对应的小鼠MT-ND4 m.G11185A突变模型，该模型表现出典型的LHON表型（视网膜层变薄、视网膜神经节细胞（RGC）退化、视觉功能障碍）；随后通过玻璃体内注射表达sTALED-V28R的AAV2载体，平均纠正了RGC中约36%的突变异质性，恢复了视网膜厚度，增加了RGC数量并改善了视觉功能，首次证明了体内线粒体碱基编辑的治疗潜力。研究人员还通过合子先导编辑（prime editing）在SJL/JRj多发性硬化（MS）小鼠模型中成功纠正了两个候选基因点突变中的一个，证明了先导编辑在生殖系精确校正中的可行性，为验证候选基因在髓鞘再生中的作用奠定了基础。在嵌合模型方面，研究人员通过8细胞期胚胎聚合技术成功构建了APP23和Tau58/2嵌合小鼠模型，使人类APP和tau蛋白在脑组织中不同、非重叠的细胞群中表达，绕过了传统双转基因杂交的胚胎致死问题，为研究淀粉样蛋白-tau相互作用和tau传播提供了新平台。
在非小鼠物种研究方面，研究人员开发了刺毛鼠（Acomys dimidiatus）的基因组编辑平台，通过阴道细胞学定时交配和优化的超数排卵方案（PMSG/hCG），提高了胚胎产量，并评估了工程化病毒样颗粒（eVLP）输卵管注射和iGonad电穿孔方法，初步结果表明iGonad方法可实现刺毛鼠输卵管胚胎的成功电穿孔。猪研究方面，研究人员验证了V2G位点作为安全港位点（safe harbor）支持Cre介导的连续转基因操作（RMCE），成功将7个转基因（7TG）整合至三重敲除（αGal/Neu5GC/Sda）的V2G靶向猪系中，并通过体细胞核移植（SCNT）获得了4头存活克隆猪，证实了该位点用于连续遗传操作的可行性。水牛研究方面，研究人员利用CRISPR/Cas9 RNP核转染水牛成纤维细胞，靶向催乳素受体（PRLR）基因外显子10，建立了约41%编辑效率的克隆细胞群体，并通过SCNT成功生产了携带杂合双等位基因编辑的囊胚（囊胚形成率54.2%），为培育耐热水牛奠定了基础。兔研究方面，美国国立卫生研究院（NIH）资助的国家转基因兔模型转化研究中心（NCRM）正式启动，旨在扩大高转化相关性基因工程兔模型的获取渠道，目前已建立超过50个基因工程兔品系。
在资源与质控方面，研究人员评估了小型样本基因分型技术（qPCR）在冷冻种质（小鼠和斑马鱼精子）解冻后基因分型和遗传背景鉴定中的应用，建立了仅需10 μl精子（一根细管）即可获得足够DNA的方案；同时证实交配栓（copulatory plug）基因分型可有效预筛具有种系传递能力的嵌合体创始人，减少不必要的繁育。针对小鼠资源库面临的挑战，研究人员指出CRISPR时代导致资源库品系沉积和请求数量下降，且约50%的MMRRC品系存在遗传不一致问题，仅约20%完全符合预期遗传特征，强调加强遗传质量控制（如GenoCheck服务）和推广LAG-R报告框架的必要性。此外，研究人员还开发了基于成纤维细胞（FAME）的体外验证方法，利用成年小鼠耳夹活检组织培养成纤维细胞，用于制备高分子量DNA和验证条件等位基因功能，减少了对活体动物的依赖。
三、关键技术与方法
本研究涉及的主要关键技术方法包括：CRISPR/Cas9基因编辑技术（含RNP电穿孔、显微注射、亚透明带注射）；整合酶（Bxb1、Pa01）介导的大片段DNA定点整合；重组腺相关病毒（rAAV）供体递送；细胞穿透肽（TAT-HA2）介导的Cas蛋白递送；先导编辑（prime editing）；线粒体碱基编辑（Hifi-DdCBE、sTALED）；dCas9与Cas9联合编辑策略；CRISPR-SWITCH单等位基因编辑策略；短条件性内含子（SCON）条件性敲除技术；条件性反转（COIN）策略；胚胎聚合（chimeric embryo aggregation）技术；体细胞核移植（SCNT）；长读长测序技术（ONT纳米孔测序、PacBio HiFi测序）及其衍生方法（LOCK-seq、CTM-nSeq、DAJIN2分析、无扩增多重HiFi测序）；深度学习辅助设计（Pythia框架）；非手术胚胎移植（NSET）；经宫颈人工授精（transcervical AI）；交配栓基因分型；冷冻种质解冻基因分型；阴道细胞学定时交配与超数排卵（PMSG/hCG）；流式细胞术、免疫细胞化学（ICC）、Western blot（WB）等表型验证技术。样本队列来源涵盖多个国际机构，包括英国Francis Crick研究所、CRUK曼彻斯特研究所、加拿大麦吉尔大学、美国华盛顿大学圣路易斯分校、美国加州大学欧文分校、英国MRC哈威尔玛丽莱昂中心、瑞士巴塞尔大学、比利时列日大学、韩国高丽大学与首尔大学、芬兰赫尔辛基大学、意大利Avantea、印度ICAR国家乳品研究所、以色列特拉维夫大学、美国密苏里大学等。
四、研究结果分述
3Rs奖获奖研究（伤口闭合优化）：研究人员通过结合埋藏式皮下连续缝合与单层组织粘合剂的方法，替代传统外部缝合和多层胶水，在326例胚胎移植中仅2%需要重新缝合（传统胶水法为10%），无动物因伤口并发症被处死，虽手术时间增加约4分钟，但显著改善了动物福利并减少了受体损失。
O-1（整合酶大片段整合）：Bxb1和Pa01整合酶均成功介导18–178 kb BAC构建体在小鼠ES细胞中的位点特异性整合，ONT长读长测序确认了靶位点整合正确性和结构完整性。
O-2（亚透明带注射）：优化的亚透明带注射结合RNP电穿孔流程可实现大片段供体的高效靶向整合，支持快速处理多达100个胚胎/小时，提高活产率。
O-3（LOCK-seq揭示rAAV敲入复杂性）：LOCK-seq揭示了rAAV介导敲入中广泛的复杂编辑结果（多联体、部分整合、随机插入、嵌合体多等位基因），并识别出与最佳F1传递相关的三种模式。
O-4（细胞穿透肽编辑）：TAT-HA2处理20分钟即可在合子及4-8细胞期胚胎实现>90% Indel率，不影响囊胚发育；结合NSET实现无手术编辑。
O-5（CRISPR-SWITCH）：通过两步策略实现100%单等位基因编辑（n=30），其中50%携带目标致病突变，成功建立Syt1杂合子模型并验证种系传递。
O-6（遗传质控）：冷冻精子（≥10 μl）解冻后qPCR基因分型成功；交配栓基因分型与种系传递率相关，可预筛种系能力嵌合体。
O-7（刺毛鼠平台）：阴道细胞学定时交配获平均2±0.57胚胎/窝；超数排卵方案提高至6±2.97胚胎/雌性，但仅1.6±1.01个形态正常；iGonad电穿孔初步成功。
O-8（猪V2G安全港）：Cre介导RMCE成功将7TG整合至V2G位点，78个克隆中22个重组，21个整合全部7个转基因；SCNT后获得4头存活克隆猪，确认重组和表达。
O-9（APP/Tau嵌合模型）：通过8细胞期胚胎聚合成功构建APP23:Tau58/2嵌合体，免疫组化证实APP和tau在脑组织中不同细胞群表达。
O-10（线粒体碱基编辑治疗LHON）：Hifi-DdCBE成功构建MT-ND4突变小鼠模型（减少脱靶），表现出LHON表型；AAV-sTALED-V28R玻璃体内注射纠正约36%异质性，恢复视网膜厚度和功能。
O-11（先导编辑验证MS候选基因）：合子先导编辑成功纠正SJL/JRj小鼠两个目标突变之一，10只幼崽中2只携带校正，其中1只产生2只携带校正等位基因的后代。
O-13（NCRM兔中心）：NIH资助的国家兔模型转化研究中心启动，已建立50余个基因工程兔品系，提供模型生成、验证、冷冻保存和分发服务。
O-14（PRLR编辑水牛胚胎）：CRISPR/Cas9 RNP核转染实现约41%编辑效率，29个克隆中12个成功编辑（3个杂合双等位、9个单等位）；SCNT后囊胚形成率54.2%，单囊胚测序确认编辑。
O-15（Whitten效应优化IVF）：供体雌鼠在超数排卵前用成熟雄鼠垫料同步化4天，虽获卵数和闭锁卵数无差异，但受精卵数显著增加，提示卵母细胞质量提高。
O-16（AAV供体细胞敲入）：开发了AAV供体DNA结合RNP电穿孔的细胞系敲入方案，通过GFP/RFP标记Cas9分选阳性克隆，优化了同源臂大小、递送方式和分选策略。
O-17（ONT-DAJIN2流程）：ONT长读长测序结合DAJIN2分析将G0筛选时间减少50%，可同时鉴定多种编辑结果，促进3Rs原则。
O-18（Pythia设计平台）：深度学习框架Pythia可预测Cas9切割位点修复结果并设计AI优化的微同源臂，在人类细胞系30余位点、非洲爪蟾安全港和内源位点、成年小鼠脑神经元（非分裂细胞）中实现可预测的单拷贝整合和蛋白标记。
O-19（CTM-nSeq）：Cas12a介导的靶向多重纳米孔测序支持同一DNA样本多位点并行分析，兼容最新ONT化学，成本低于其他长读长方法。
O-20（交叉遗传策略）：基于单细胞转录组数据识别出独立于cDC1/cDC2的CCR7+常规树突状细胞（cDC）群体，通过cDC特异性Cre驱动子和CCR7位点条件性表达白喉毒素或荧光标记，实现对该群体的条件性清除或标记。
O-21（dCas9:Cas9联合）：80:20和90:10 dCas9:Cas9比例显著提高胚胎至幼崽存活率；80:20比例增加野生型等位基因出现和突变率，HDR率无显著差异；种系传递不受影响；旁系同源簇脱靶突变消除。
O-22（mTmG统一报告平台）：将广泛可用的mTmG小鼠品系改造为统一荧光报告平台，可区分核酸酶敲除、HDR、HITI、重组酶介导插入、碱基编辑和先导编辑等不同编辑模态，通过荧光显微镜、流式细胞术和纳米孔测序验证。
P-01（COIN策略）：利用FLeX/COIN方法将含剪接受体、P2A、荧光报告基因和SV40 polyA的盒式序列反向插入内含子，Cre存在时反转并激活报告基因表达，成功生成4种cKO小鼠品系。
P-02（荧光报告基因作为填充序列）：含CMV启动子和SV40 polyA的荧光报告基因转录单元可作为rAAV包装填充序列，UV可视化可初步识别随机整合幼崽；但随机整合可能伴随rAAV基因组部分缺失或重排，导致无荧光表达。
P-03（牛iPSC向卵母细胞分化）：通过慢病毒转导OCT4、SOX2、c-MYC、KLF4成功重编程牛新生儿成纤维细胞为iPSC，经EB形成、BMP4等因子诱导PGCLC，维甲酸促进减数分裂，GDF9/BMP15/FSH/雌酮促进卵母细胞样细胞形成，表达卵母细胞相关基因。
P-04（FAME方法）：从单个耳夹活检组织培养成年小鼠成纤维细胞，4周内获得数百万细胞，可制备高分子量DNA和验证条件等位基因功能（转染重组酶），减少动物使用。
P-05（delta等位基因陷阱）：仅用野生型和flox引物基因分型可能漏检重组酶介导切除的delta等位基因，导致小鼠被误判为纯合野生型或flox，推荐使用三个独立检测（野生型、flox、delta）。
P-06（Emilin-1在外周神经中的作用）：9月龄Emilin1敲除小鼠四肢悬挂试验显示运动缺陷，腓肠肌重量提示萎缩；超微结构分析显示g比值总体增加，3-5 μm轴突类群（最丰富群体）髓鞘选择性变薄。
P-07（猪主动脉内皮细胞分离）：优化胶原酶消化（20分钟）结合CD31磁珠分选，获得均质内皮细胞形态，CD31+比例84.8%（分选）vs 73.9%（未分选）；细胞形成毛细血管样网络，保留血管生成能力。
P-08（SCON条件性敲除Cmtr2）：利用189 bp短条件性内含子（SCON）盒式序列插入Cmtr2编码外显子5'端，Cre重组后删除分支点阻止剪接并引入终止密码子；2只后代确认完整插入，功能验证正确。
P-09（SCON通用性）：SCON系统在小鼠（27个内源基因）、斑马鱼（3个）、人iPSC（7个）和肠道类器官中均实现高效条件性敲除；开发GenPos-SCON数据库支持300余种脊椎动物的设计。
P-10（ssODN方向性分析）：回顾性分析14个敲入项目约600只G0小鼠，发现ssODN方向性（正义/反义）与HDR整合效率无显著相关性，但存在位点特异性偏好，强调经验优化必要性。
P-11（GenoCheck服务）：开发独立验证小鼠模型关键遗传特征（亚品系组成、残留供体基因组、突变结构）的服务，案例显示可检测意外遗传背景和等位基因不一致，防止误导性实验结果。
P-12（RAD51/BCCIP可重复性）：在两种插入大小（<100 bp和>1 kb）模型中，RAD51或BCCIP补充均未显著提高纯合转换频率，与已发表结果不一致，提示该策略的适用性存在局限。
P-13（CRISPR时代小鼠资源库挑战）：CRISPR导致资源库品系沉积和请求下降；MMRRC品系中约50%存在遗传不一致，仅约20%完全符合预期；强调加强遗传质量控制和报告标准化。
P-14（无扩增HiFi测序验证）：PacBio HiFi测序结合Cas9富集，在包括Rosa26在内的挑战性位点获得满意覆盖，实现成本效益高的无扩增多重验证。
P-15（冷冻精子经宫颈AI）：使用3D打印装置进行手动宫颈刺激诱导假孕，结合商业mC&I装置经宫颈转移新鲜和冷冻精子，观察到妊娠、着床位点和活产，但结果不一致且不可靠。
五、讨论与结论
综合本届会议的研究成果，转基因技术领域正朝着更高效、更精准、更符合3Rs原则的方向快速发展。整合酶系统、细胞穿透肽递送、先导编辑和线粒体碱基编辑等新工具显著拓展了基因修饰的可行性和适用范围，特别是在大片段整合、致死基因编辑、线粒体疾病模型和治疗等此前难以攻克的领域取得了突破性进展。长读长测序技术（ONT、PacBio）及其衍生方法（LOCK-seq、CTM-nSeq、DAJIN2分析）正在改变基因编辑结果的验证范式，从传统的PCR/Sanger方法转向全面、无偏的结构解析，不仅提高了创始人筛选效率，还揭示了许多此前被隐藏的复杂编辑结果，为理解编辑机制和优化设计提供了重要依据。dCas9:Cas9联合策略和CRISPR-SWITCH等方法则提供了精细调控编辑结果（如保护等位基因、强制杂合性）的实用方案。同时，非小鼠物种（兔、猪、水牛、刺毛鼠）的基因编辑平台建设取得重要进展，为转化研究和再生医学提供了更广泛的模型选择。小鼠资源库面临的遗传质量控制挑战凸显了标准化报告和独立验证服务（如GenoCheck、LAG-R框架）的重要性。总体而言，TT2026会议展示了转基因技术从工具创新、流程优化到资源整合的完整创新生态，这些进展将加速疾病机制研究和治疗策略开发，同时通过减少动物使用和优化实验设计，切实推动了3Rs原则在生物医学研究中的落实。
