链脲佐菌素诱导的痴呆大鼠下丘脑星形胶质细胞培养物的衰老表型

《Neurochemical Research》：The Senescent Phenotype of Cultured Hypothalamic Astrocytes from Rats with Streptozotocin-Induced Dementia

　　

摘要：阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是最常见的痴呆类型，衰老是其首要危险因素。在散发性AD的实验模型中，啮齿动物脑室内（intracerebroventricular, ICV）注射链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）被广泛使用。研究人员假设STZ加速细胞衰老过程，星形胶质细胞的衰老可通过经典标志物评估，包括p16、β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）、Lamin B1和衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）。为探讨这一问题，研究人员在STZ-ICV模型诱导后四周，培养了成年雄性Wistar大鼠的下丘脑星形胶质细胞，以研究在体内观察到的星形胶质细胞改变是否在体外条件下得以维持，以及STZ动物来源的星形胶质细胞中衰老标志物是否更明显。与STZ痴呆模型一致，星形胶质细胞培养物表现出谷氨酰胺合成酶和谷胱甘肽水平降低。此外，观察到转录因子FOXO3a、Nrf2和NF-κB水平升高。STZ动物来源的星形胶质细胞中未折叠蛋白反应标志物（CHOP和sorcin）也增加。在评估衰老参数时，观察到p53、p21和p16增加，而Lamin B1水平保持不变。关于SASP，TNFα以及细胞外HMGB1和S100B水平的调节也提示衰老表型的诱导。综上所述，这些发现表明，培养的星形胶质细胞保留了STZ诱导的痴呆体内模型中观察到的关键改变，突显了其用于研究AD和治疗策略的价值。培养物中的观察结果表明，STZ确实诱导星形胶质细胞衰老，并且S100B可纳入星形胶质细胞SASP的组成成分。

论文解读：STZ诱导的痴呆大鼠下丘脑星形胶质细胞衰老表型的体外研究

一、研究背景与目的

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是最常见的痴呆类型，约占所有痴呆病例的80%。其组织病理学特征包括细胞外错误折叠淀粉样β肽（amyloid-β, Aβ）聚集形成的老年斑或淀粉样斑块，以及过度磷酸化tau蛋白形成的神经原纤维缠结；此外，星形胶质细胞改变先于并伴随神经元改变。临床上，AD表现为记忆丧失、语言障碍和行为改变，最终导致功能与社交能力丧失。超过95%的AD病例为散发性，衰老是其主要危险因素。在模拟散发性AD的动物模型中，脑室内（intracerebroventricular, ICV）给予链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）——一种葡萄糖胺-亚硝基脲化合物——被广泛使用，该模型先诱导中枢神经系统葡萄糖代谢减退（前淀粉样蛋白期），数月后出现Aβ肽增加与沉积（淀粉样蛋白期）。STZ的确切作用机制尚不完全清楚，但其可加速AD遗传模型动物中特征性病理标志的出现，并在皮层星形胶质细胞培养物中损害β-淀粉样肽的清除并诱导淀粉样前体蛋白产生。研究人员假设STZ可加速细胞衰老进程，而星形胶质细胞衰老可通过经典标志物如p16、β-半乳糖苷酶、Lamin B1及衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）评估。由于下丘脑和 cerebellum 是星形胶质细胞衰老易感性最高的脑区，且下丘脑在调节全身代谢和下丘脑-垂体-肾上腺轴中起关键作用，因此本研究选择下丘脑星形胶质细胞作为研究对象。该研究旨在探讨STZ-ICV模型诱导后，体内观察到的星形胶质细胞改变是否能在体外培养条件下维持，以及STZ动物来源的星形胶质细胞是否表现出更明显的衰老标志物。该论文发表在《Neurochemical Research》。

二、研究方法概述

研究人员从巴西阿雷格里港联邦大学（UFRGS）当地繁殖中心（CREAL-UFRGS）获取40只成年雄性Wistar大鼠（90日龄，体重266–383 g），随机分为对照组和STZ组。STZ组大鼠经ICV注射3 mg/kg STZ建立散发性AD模型。模型诱导后第27天进行新物体识别（novel object recognition, NOR）任务评估认知功能；第30天处死动物，在层流罩中分离下丘脑，进行原代星形胶质细胞培养，约30天后细胞融合。主要技术方法包括：Western blotting检测蛋白质含量，RT-qPCR检测基因表达，ELISA检测细胞内外分泌因子（BDNF、HMGB1、S100B、TNFα及GFAP），免疫荧光检测p53蛋白分布，荧光法测定还原型谷胱甘肽（GSH）含量。所有数据以对照组百分比或倍数表示，采用Student’s t检验进行统计学分析。

三、研究结果

1. STZ诱导认知障碍大鼠的原代星形胶质细胞培养

为确认痴呆模型建立成功，研究人员对STZ-ICV处理四周后的大鼠进行NOR任务测试。结果显示，与对照组相比，STZ组大鼠在训练后1小时和24小时对新物体的探索时间均未显著高于50%随机水平，表明短时和长时记忆均受损，证实sAD模型成功诱导。

2. STZ大鼠培养星形胶质细胞的表征

培养细胞中GFAP阳性细胞超过95%，提示星形胶质细胞纯度较高。Western blotting和ELISA检测均显示STZ组与对照组GFAP含量无显著差异。然而，STZ组星形胶质细胞中谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase, GS）蛋白含量显著降低，GSH含量也显著减少。这与此前在STZ痴呆模型海马中观察到的改变一致，表明星形胶质细胞活性受损和抗氧化能力下降。此外，谷氨酸转运体GLAST和GLT-1含量无显著变化。

3. STZ动物培养星形胶质细胞呈现更衰老的表型

衰老相关标志物检测显示，STZ组星形胶质细胞中p53蛋白含量显著增加（Western blotting及免疫荧光验证），p21的蛋白含量和基因表达均显著上调，p16基因表达显著增加但其蛋白含量无显著改变，Lamin B1蛋白含量亦无显著变化。研究人员认为，p16蛋白未增加而仅基因水平升高，可能反映细胞处于衰老早期阶段。

4. 衰老星形胶质细胞中S100B分泌增加

SASP组分分析显示，STZ组细胞内S100B含量无变化，但基础分泌（1小时）显著增加；HMGB1细胞内含量无变化，但基础分泌显著增加；TNFα细胞内含量显著增加，但分泌水平无变化；BDNF的细胞内含量和分泌均无显著变化。这些结果表明S100B和HMGB1的分泌可能构成STZ诱导的星形胶质细胞SASP的一部分，且S100B作为星形胶质细胞特异性蛋白，或可纳入星形胶质细胞SASP组分。

5. STZ动物星形胶质细胞培养物中UPR蛋白升高

未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）相关基因表达检测显示，STZ组CHOP表达升高约5倍，sorcin表达升高约3倍，提示内质网应激的存在。

6. 衰老星形胶质细胞培养物中FOXO3a及NFκB和Nrf2表达增加

转录因子基因表达分析显示，STZ组NF-κB、Nrf2和FOXO3a表达均增加约3倍，表明炎症和氧化应激相关信号通路激活。

四、讨论与结论

本研究首次利用体内STZ-ICV模型来源的原代下丘脑星形胶质细胞培养物，探讨在体内诱导的衰老相关改变能否在体外维持。结果显示，培养的星形胶质细胞保留了模型动物的关键改变，包括GS/GSH降低、p53/p21/p16上调、SASP组分分泌变化、UPR激活及NF-κB/Nrf2/FOXO3a表达增加。这些发现支持STZ确实诱导星形胶质细胞衰老，且该培养体系可作为研究AD及筛选治疗策略的体外模型。研究人员也承认，由于下丘脑与海马在衰老敏感性和功能上的差异，体外结果与既往体内海马研究直接比较存在局限性；尽管如此，该模型仍为理解细胞衰老在STZ诱导AD模型中的作用提供了新工具。

结论部分原文翻译如下：我们的数据表明，来自ICV-STZ大鼠模型（阿尔茨海默型痴呆）的下丘脑星形胶质细胞培养物表现出衰老标志物（如p53、p21和p16）增加，以及氧化应激和神经炎症标志物（如GSH、Nrf2、NFκB和TNFα）增加。这些培养物中S100B分泌增加提示该蛋白可被纳入星形胶质细胞SASP的组成成分。综上，这些数据表明来自这些动物的培养星形胶质细胞保留了这些改变，从而有助于在体外更全面地理解该模型和疾病，而衰老正是该疾病的主要危险因素。