《Journal of Molecular Evolution》：Protein Language Model Embeddings Recover Evolutionary and Functional Organization Across the Ras Superfamily
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Ras蛋白超家族由共享保守G结构域（G-domain）的小GTP酶组成，但在侧翼区域、调控机制和细胞功能上存在差异。由于现有分类主要依赖G结构域系统发育（G-domain phylogeny），该超家族为评估蛋白质语言模型嵌入（protein language
Ras蛋白超家族由共享保守G结构域（G-domain）的小GTP酶组成，但在侧翼区域、调控机制和细胞功能上存在差异。由于现有分类主要依赖G结构域系统发育（G-domain phylogeny），该超家族为评估蛋白质语言模型嵌入（protein language model embeddings）能否恢复与已有进化分类一致的生物学序列组织提供了一个有用的测试案例。在此，研究人员采用三种分类方案分析了经过整理的Ras超家族数据集：经典五家族视图、基于G结构域系统发育的分类以及UniProtKB家族注释分类。研究人员通过监督分类（supervised classification）、无监督聚类（unsupervised clustering）和残基层面消融（residue-level ablation）比较了多种蛋白质语言模型的嵌入。序列衍生的嵌入在所有分析中均恢复了已知的Ras超家族组织。在监督分析中，简单的线性分类器实现了高性能，表明Ras家族和亚家族信息可从序列衍生嵌入中线性获取。在无监督分析中，ESM-C-300第12层在全蛋白水平对基于G结构域系统发育的分类恢复最强，而ProstT5在G结构域嵌入中表现最佳。残基消融识别出G结构域内外反复出现的候选亚家族信息区域，包括映射到与亚家族特异性调控或相互作用功能相关的结构连贯区域的信号。总之，这些结果表明蛋白质语言模型嵌入提供了Ras家族和亚家族组织的有效无比对表示（alignment-free representation），并可仅从序列中突出显示与功能特化相关的候选序列区域。
蛋白质语言模型嵌入揭示Ras超家族的进化与功能组织：一项系统性解读
一、研究背景与科学问题
Ras蛋白超家族是一类由共享保守GTP酶结构域（G-domain）的小GTP酶组成的分子开关，调控信号转导、囊泡运输、细胞骨架组织和细胞周期等关键细胞过程。传统上，该超家族的分类高度依赖于对保守G结构域的进化与系统发育分析，因为该区域可在远缘蛋白间可靠比对。然而，G结构域之外的区域保守性差，难以用于基于比对的系统发育分析，但这些可变区域恰恰是亚家族功能特异性的主要贡献者。
随着大规模测序计划以前所未有的速度产生蛋白质序列数据，传统的多序列比对和系统发育重建方法面临可扩展性瓶颈——序列数量和多样性增加会导致比对质量下降，且计算成本高昂，难以集成到自动化工作流中。大型蛋白质语言模型（protein language models）提供了一种互补策略，可直接从序列中学习复杂模式，无需显式多序列比对。Ras超家族因其保守催化核心与高度分化的序列、膜靶向区域、附属结构域及多样细胞功能的结合，成为检验蛋白质语言模型嵌入能否恢复与已有分类一致的组织结构的理想测试案例。
二、研究方法与技术路线
研究人员选取了来自9种模式生物和3种非模式生物的151条代表性小GTP酶序列，这些序列源自Rojas等人（2012）基于G结构域系统发育树构建的精选数据集。研究采用三种分类方案进行对比：经典五家族分类（Classic）、UniProtKB家族描述分类（Family.name）和基于进化树的精细分类（JCB.2012）。关键技术方法包括：（1）利用四种预训练蛋白质语言模型（Ankh3、ProtT5、ProstT5、ESM-C-300及其第12层）直接从氨基酸序列生成全蛋白和G结构域嵌入（embeddings），经均值池化、特征中心化、L2归一化和主成分分析降维后用于下游分析；（2）采用五种无监督聚类算法（k-means、层次聚类、DBSCAN、HDBSCAN、谱聚类）评估嵌入空间对分类结构的恢复能力，并以调整兰德指数（Adjusted Rand Index, ARI）和归一化互信息（Normalized Mutual Information, NMI）等指标量化聚类性能；（3）通过留一法交叉验证训练多项逻辑回归线性探针（linear probe）进行监督分类；（4）开发基于滑动窗口（窗口大小为7个残基）的残基消融分析（residue ablation），通过掩蔽局部残基嵌入并测量分类决策边界的变化来识别影响亚家族分类的关键序列区域。
三、主要研究结果
序列衍生嵌入实现Ras亚家族的精确监督分类
研究表明，所有嵌入模型在三种分类方案下均能通过简单线性分类器实现高精度分类。对于精细的JCB.2012分类，使用ESM-C-300第12层的G结构域嵌入达到最优性能（准确率0.980，宏平均F1值0.975）；全蛋白嵌入同样表现强劲（准确率0.950，宏平均F1值0.860）。对于宽泛的Classic分类，ProstT5的G结构域嵌入获得最高性能（准确率0.993，宏平均F1值0.992）。这表明Ras家族和亚家族信息在嵌入空间中呈线性可分离状态，嵌入质量而非分类器复杂度是主导因素。
无监督分析无需标签即可恢复不同Ras超家族分类
在无监督条件下，蛋白质语言模型嵌入恢复了与已有分类一致的结构。全蛋白嵌入中，ESM-C-300第12层配合k-means聚类在JCB.2012分类上取得最佳一致性（ARI=0.789，NMI=0.927，同质性=1.000）。G结构域嵌入中，ProstT5配合谱聚类同样在JCB.2012上表现最优（ARI=0.781，NMI=0.898）。值得注意的是，嵌入空间与精细的JCB.2012分类最为吻合，而对宽泛的Classic分类恢复较弱（最佳ARI仅为0.51），表明嵌入结构更贴近基于G结构域系统发育的精细亚家族划分。
不同蛋白质语言模型暴露部分不同的Ras家族序列信号
各嵌入模型在不同分类方案、输入区域和分析设置下的表现存在差异。ESM-C-300第12层在整体上最为稳健，但在全蛋白聚类中Ankh3对Classic分类表现最佳，在G结构域聚类中ProstT5对JCB.2012最优。这种任务依赖性提示不同模型以不同强度编码了序列变异的多个方面，包括宽泛的家族相似性、结构域中心信号和精细的亚家族差异。ProstT5在G结构域分析中的优势可能与其训练过程中整合了结构信息有关。
残基消融揭示与亚家族特化相关的候选区域
残基消融分析识别出重复出现的亚家族特异性模式，分为G结构域内和结构域外两类。在G结构域外，全蛋白消融在Arf样蛋白（f2）的N端和CDC42样蛋白（f7）的C端发现重复峰，分别对应已知的高尔基体靶向和膜结合功能区域。在G结构域内，RAS相关亚家族（f5）中围绕第75位和第109位残基出现重复峰，其中第109位对应已知的翻译后修饰热点（K104 in RAS），第75位则与之前鉴定的功能未知的特异性决定残基（specificity-determining positions, SDPs）一致。这些消融信号与经典SDP框架的关系是互补而非等价：SDP反映的是组水平的保守判别列，而消融识别的是影响单个序列嵌入分类的局部区域。
跨模型收敛具有亚家族依赖性且发生在GTPase结构域的不同位置
对五种代表性蛋白的结构映射显示，不同模型在同一GTPase结构域内的最强消融峰有时会收敛于相同的局部结构邻域，但这种收敛是不完全的且具有亚家族依赖性。例如，在RHEB_HUMAN（f5）中，三个模型收敛于N端G1区域附近；在RAN_HUMAN（f10）中，三个模型在G4-G5邻域重叠；而在CDC42_HUMAN（f7）中，三个模型共享一个位于注释G盒之外的内部表面（残基132-137）。这进一步证实不同模型在相同保守GTPase支架上恢复了部分重叠但截然不同的结构决定簇。
四、研究结论与意义
本研究以Ras超家族为严格测试案例，证明蛋白质语言模型嵌入能够以无比对方式恢复具有生物学意义的序列组织。监督和无监督分析均表明，序列衍生嵌入捕捉到了与已有家族和亚家族分类一致的结构信息，包括最初通过G结构域比较分析建立的精细JCB.2012分类。残基消融分析揭示了G结构域内外与亚家族特化相关的候选区域，包括与膜靶向、定位和家族特异性调控相关的N端和C端信号。
研究结论指出：蛋白质语言模型嵌入为经典的进化分析和专家整理方法提供了可扩展的无比对补充手段。它们不能替代多序列比对、系统发育重建或专家整理，但当需要确定精确的进化历史或残基层面机制时，它们可直接从序列中恢复大部分相同的组织结构，支持准确的自动分类，因此在大规模蛋白质注释中具有重要应用价值。更广泛而言，基于嵌入的分类和消融分析为大规模蛋白质注释和生成关于功能多样化背后序列区域的可检验假设提供了实用框架。
