《Journal of Plant Growth Regulation》：Exploring the Molecular Pathways of Coffee Flowering Time: A Comparative Analysis of the Semperflorens Mutant and Contrasting Elite Genotypes
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花激活与发育的分子通路已在模式物种中得到充分描述，但在具有复杂生命周期且在社会经济中具有重要意义的经济作物（如小粒咖啡 *Coffea arabica* L.）中却表现出显著多样性。咖啡植株的生殖发育呈两年生周期，开花时间对咖啡产量和杯品质量至关重要。本研究探
花激活与发育的分子通路已在模式物种中得到充分描述，但在具有复杂生命周期且在社会经济中具有重要意义的经济作物（如小粒咖啡 *Coffea arabica* L.）中却表现出显著多样性。咖啡植株的生殖发育呈两年生周期，开花时间对咖啡产量和杯品质量至关重要。本研究探讨了三种对比鲜明的咖啡基因型在花发育和开花时间方面的可塑性，以阐明相关的代谢和转录调控图谱。首先，研究人员比较了三种咖啡基因型的生殖发育，确认Acau?为晚花基因型，Oeiras为早花基因型，而天然突变体Semperflorens（Sf）则全年持续开花。随后，糖和乙烯含量分析揭示了不同基因型在叶片和花芽中的定量差异。为将这些表型差异与调控性发育通路相关联，研究人员进行了RNA-seq分析，比较了不同基因型的茎尖分生组织、花芽和叶片。由此鉴定出12,478个差异表达基因，这些基因在基因本体论（Gene Ontology, GO）术语中显著富集，主要涉及激素调控、外部刺激和花发育。有趣的是，咖啡基因型间的差异似乎与乙烯和生长素相关通路有关。此外，一些生殖发育的关键调控因子，如FLOWERING LOCUS T和MADS-box基因的同源物，表现出对比鲜明的表达模式，通常在Sf突变体中异位上调。这些发现与咖啡基因型间观察到的表型差异相关联。总体而言，本研究推进了研究人员对咖啡花发育及其可塑性的理解，为指导育种计划和未来聚焦于调控花发育及提高作物生产力的研究提供了宝贵见解。
**咖啡开花时间分子通路的研究进展与比较转录组学解析**
**一、研究背景与科学问题**
植物的开花过程受到多种外部环境信号和内部内源信号的精细调控，这些信号共同决定分生组织从营养生长向生殖生长转变的时机。在模式物种中，光周期、赤霉素、春化、衰老和自主通路已被充分阐明，但糖类营养状态、逆境胁迫以及其他植物激素同样在这一过程中发挥着基础性作用。不同植物物种间的这些通路既相互关联又存在分歧，反映了多样的生殖策略以及确保繁殖成功的复杂调控关系。与小粒咖啡（*Coffea arabica* L.）相关的开花调控研究尤为复杂，一方面由于其作为木本多年生植物呈现两年生生殖周期，受外部和内部刺激的双重调控；另一方面，其异源四倍体基因组在现代品种中具有较近的多样化历史。这一复杂的生物学背景使得解析咖啡开花时间调控网络成为一项具有挑战性的研究课题。
咖啡的开花模式被归类为同步型开花，即在特定地理区域内花同时开放，但开花事件的数量取决于土壤气候特征（尤其是干旱和降雨模式）而有所不同。这种非同步开花导致果实发育起点参差不齐，进而造成采收期果实生产不均，损害产量和杯品质量。已有研究尝试通过干旱后复水等农艺措施同步化咖啡开花事件，以改善果实成熟的一致性，并发现这一过程与乙烯生物合成和信号通路相关基因的调控有关——干旱后复水通过提高芽中乙烯水平和增强乙烯敏感性（如通过CaETR4-like受体）来促进花开放。然而，乙烯在不同物种中对开花的调控方向并不一致，如在菠萝中乙烯诱导促进自然开花，而在水稻中乙烯信号则延迟花转变。此外，脱落酸（ABA）在干旱期升高并与花芽S4状态休眠相关，而植株复水则促进ABA下降和赤霉素（GA）水平上升。除激素外，碳水化合物是另一类关键的生殖转变内源调控因子——蔗糖水平在营养生长向生殖生长转换期间特征性升高，既作为指导发育程序的核心信号线索，又为花器官发生提供必需的能量底物。然而，关于糖代谢如何影响咖啡开花过程的信息仍然有限，糖信号调控开花时间的具体机制在咖啡中仍鲜有表征。
在此背景下，本研究提出科学假说：咖啡开花时间的表型可塑性——从优良基因型Acau?和Oeiras的受季节门控的开花，到Semperflorens（Sf）突变体的连续开花——由不同的初级糖分配策略以及关键激素和花同源异型主控网络的差异性和异位激活所驱动，这些机制使分生组织转变与季节性环境约束脱钩。基于这一假说，研究人员比较分析了早花基因型Oeiras、晚花基因型Acau?以及连续开花突变体Sf三种截然不同的咖啡基因型，系统研究了其生殖发育的表型差异、糖和乙烯含量变化以及茎尖分生组织（SAM）、花芽（FB）和叶片组织的转录组特征。该研究发表在《Journal of Plant Growth Regulation》，对理解复杂发育周期作物的花发育可塑性以及指导育种计划具有重要的科学意义和应用价值。
**二、主要关键技术方法**
该研究使用了三种具有对比生殖发育模式的小粒咖啡基因型：cv. Acau?（晚花，来源于'Mundo Novo IAC 388–17'与'Sarchimor IAC 1668'杂交）、cv. Oeiras（早花，来源于'Caturra Vermelho'与'Híbrido de Timor'杂交的Catimor基因型）以及自然突变体Semperflorens（Sf，在'Bourbon'遗传背景下发生突变而全年开花）。实验于2020–2021收获季在巴西拉夫拉斯联邦大学（UFLA）的实验田进行。主要技术方法包括：（1）每月跟踪观察花芽数量和发育阶段并记录开花（花开放）事件；（2）采用比色法对完全展开叶片进行淀粉、蔗糖、总可溶性糖和还原糖含量测定，并利用气相色谱法对叶片和花芽进行乙烯释放量测定；（3）对叶片、花芽和茎尖分生组织进行链特异性RNA提取和转录组测序（RNA-seq），共构建48个cDNA文库，利用MGI-tech DNBSEQ-G400测序仪产生约27.6亿条双端读段；（4）将RNA-seq读段比对到小粒咖啡参考基因组（Cara_1.0），利用edgeR（GLM模式）进行差异表达基因（DEGs）鉴定（FDR < 0.05，|log?FC|≥1），并通过topGO包进行基因本体论（GO）富集分析（Fisher精确检验，p < 0.05）。
**三、研究结果**
*咖啡基因型表现出不同的花发育模式和开花时间*
通过对三种咖啡基因型的生殖发育进行追踪，确认了Acau?为晚花基因型而Oeiras为早花基因型。从4月到6月，Oeiras的花芽发育加速推进至S3后期阶段，而Acau?发育速率较慢，大部分花芽停留在S2阶段。Sf突变体在整个评估期间呈现混合的生殖阶段（包括果实），与其连续开花特性完全一致。两种优良基因型均出现4次开花事件，其中两次主要的开花事件花数量较多；而Sf则呈现5次开花事件，全年完全异步分布。在果实发育方面，早花Oeiras在12月已迅速到达F4阶段，晚花Acau?仅处于F1初期，Sf则同时着生多个发育阶段的果实。
*碳水化合物和乙烯定量揭示咖啡基因型间的差异支持生殖发育差异*
淀粉含量从3月到8月逐步增加，Sf突变体在大部分时期维持显著较高的基础淀粉水平，以支持其持续的生殖消耗。蔗糖含量在Acau?中从6月到8月表现较高水平，表明其在临近晚花事件时具有独特的碳分配策略。总可溶性糖在Acau?和Sf中呈现相似季节趋势并于7月达到峰值，而Oeiras从3月到4月增加后趋于稳定。还原糖从3月到9月逐渐增加，Acau?在3月至6月维持较高水平。乙烯定量方面，叶片乙烯产量呈季节性趋势，4月达到峰值然后逐渐下降至9月，Acau?持续维持较低水平；花芽中乙烯动态高度基因型特异——Acau?和Oeiras在7月达到最高水平，而Sf在3月至5月产量较高。值得注意的是，Oeiras在临近开花前花芽中乙烯水平最高，与其早花表型一致。
*基因表达主要随器官而非基因型变化，但Sf突变体例外*
MDS分析显示整体基因表达主要由器官身份驱动而非遗传背景决定，叶片和SAM样品独立于基因型形成聚类。然而，Sf突变体的花芽显著例外——其FBs完全独立聚类，且位置更接近SAM聚类，表明Sf在花结构中维持了分化程度较低的分生组织样状态。层级聚类分析进一步证实组织身份是转录分组的主要驱动因素，但Sf花芽与未分化SAM组织聚集。叶片转录组分析显示Acau?和Oeiras在3月和8月间呈现明显的季节适应性分子变化，而Sf叶片的转录组独立于季节聚类，3月和8月间具有显著相似性，表明Sf在营养组织中维持转录稳态，对环境波动的敏感性显著降低。
*转录模式概述显示差异表达基因及咖啡组织和基因型间的相似性*
SAM与FB的转录差异反映花身份所需遗传重编程的幅度。比较显示Oeiras和Acau?在这一转变中经历大规模转录变化（分别为8,143和7,454个DEGs），而Sf突变体在这两种组织间的转录组差距显著较小（仅3,946个DEGs），表明Sf花芽维持分化程度较低的分生组织样转录状态。跨基因型比较中，Acau?和Sf的SAM转录谱高度相似（仅479个DEGs），可能与它们更近的遗传背景有关；但一旦进入FB阶段，Acau?和Oeiras的FBs具有转录一致性（937个DEGs），而Sf则与两者分别呈现5,647和6,700个DEGs的巨大差异。叶片季节比较中，Oeiras和Acau?表现出强烈的转录重编程（分别为3,866和3,666个DEGs），而Sf仅1,524个DEGs。8月干旱胁迫条件下，三种基因型采用高度不同的适应分子应答，使转录差异急剧扩大。
*花发育和叶片功能主要受乙烯和生长素相关通路调控*
GO富集分析表明，调控咖啡花发育的最主要分子驱动因子明确归属于激素调控（HR）、外部刺激（ExS）和花发育（FD）三个功能类别。在SAM到FB转变中，乙烯生物合成和信号基因在花芽中广泛上调。Oeiras在花芽中乙烯相关DEGs上调强于Acau?，与其开花前较高的乙烯产生和早花表型一致。Sf突变体花芽的HR术语占据主导地位，其次是FD，表明其连续开花性状从根本上由早期花芽分化阶段独特的、高度活跃的激素转录程序驱动。在叶片中，8月季节性干旱在Oeiras和Acau?中触发乙烯响应基因的显著上调，而Sf突变体的DEGs数量较少且主要偏向生长素调控。这些结果表明乙烯是优良品种花芽激活和干旱响应的主要季节性开关，而生长素调控在调节Sf突变体的非典型发育轨迹中发挥独特中心作用。
*主要花调控基因的差异表达可能解释观察到的咖啡表型*
Venn图分析显示17个与花调控相关的候选基因表现出值得关注的差异表达模式。在激素相关DEGs中，两个乙烯响应因子（ERF027-like和ERF038-like）在Sf中下调。相反，一个生长素合成酶和一个赤霉素双加氧酶在Sf的FBs和SAM中显著上调。在花转变方面，被注释为HEADING DATE 3A-like（Hd3a-like）的基因——与咖啡成花素CaFT1相同——在Sf FBs中强烈表达，并在Sf SAM组织中异位表达。PEBD家族同源物（CEN-like和MOTHER of FT/TFL1）、SQUAMOSA PROMOTER-BINDING-like PROTEIN 3和EARLY FLOWERING 5-like在Sf中也呈现类似的异位上调模式。关键ABC模型花同源异型基因CaAP1/CAL、CaAP3和CaPI在Sf突变体FBs中显著上调。相反，花抑制因子和营养维持基因如SVP-like、SOC1-like和AGL27在Sf FBs中下调。此外，发育调控因子如ACIDIC ENDOCHITINASE-like和VIN3-like PROTEIN 2在Sf FBs中过表达，而LIGHT-DEPENDENT SHORT HYPOCOTYLS 10-like、NRT1/PTR FAMILY 2.11-like和COLD AND DROUGHT-REGULATED PROTEIN CORA-like则被抑制。
**四、讨论与结论**
讨论部分指出，小粒咖啡虽然由于较近的多倍化事件而基因组变异较低，但其基因型在花发育和开花时间方面仍表现出显著的表型可塑性。在晚花Acau?中，叶片蔗糖水平从6月到8月逐渐积累，在9月主要开花事件之前提供集中的代谢和信号线索；而Oeiras和Sf突变体中蔗糖水平在整个季节分布更均匀。Sf维持较高的基础叶片淀粉储备，表明存在持续碳储存机制以支持全年不间断的生殖活动。转录组-代谢组的一致性表明，韧皮部装载和源-库糖转运的差异调控在建立咖啡开花窗口方面发挥关键作用。
激素调控网络的整合分析揭示，乙烯的调控范围远不止于打破花芽休眠的最终阶段——在SAM到FB转变的早期阶段，乙烯机制的大规模差异表达表明其积极协调早期花器官发生。关键的是，优良品种依赖季节性水分变化触发乙烯通路，而Sf突变体通过持续的内源乙烯转录程序绕过环境依赖性。生长素在与乙烯的多激素调控网络中作为主要共调控因子，在Sf中生长素相关转录本在叶片和分生组织中的优势暗示生长素-乙烯平衡的改变促进了其连续分生组织活性和对季节性干旱的不敏感性。
在花调控层级顶端，CaFT1作为主要系统信号触发花转变。优良基因型中CaFT1转录受环境和季节因素严格门控，而Sf突变体在花芽中表现出CaFT1的大规模上调，并在SAM中异位表达——这种在未分化分生组织中的异位激活有效覆盖了外部环境触发因子的需求，降低了花承诺的阈值，维持了不间断的花诱导窗口。CaFT1下游，Sf突变体显示花分生组织身份和器官身份基因（CaAP1/CAL、CaAP3、CaPI）的显著上调，同时伴随花抑制因子（SVP-like、SOC1-like）的强烈下调。这些发现支持统一分子模型：Sf突变体的连续开花表型并非源于单一基因转变，而是多层转录去调控的结果——分生组织中异位成花素信号、MADS-box花身份基因激活以及SVP/SOC1抑制因子的抑制协同作用，绕过了环境约束以驱动不间断的生殖发育。
**研究结论**：本研究表明，小粒咖啡基因型间对比鲜明的花发育和开花时间从根本上受不同的初级碳水化合物动态和多激素调控网络控制。优良基因型Acau?和Oeiras依赖季节性环境变化（特别是水分可用性）触发糖动员和乙烯峰值以同步开花，而Sf突变体在湿季和旱季之间维持高淀粉储备和叶片转录稳态，对环境线索的敏感性降低使其能够全年维持不间断的生殖动力。在分子水平上，Sf的连续开花性状由生殖层级内的多层转录去调控驱动，包括成花素CaFT1在SAM中的大规模异位表达、ABC模型MADS-box花身份基因（CaAP1/CAL、CaAP3、CaPI）的下游激活以及花抑制因子（SVP-like、SOC1-like）的伴随抑制。这些发现将Sf确立为解析多年生作物生殖发育与环境约束脱钩机制的有力遗传模型。未来研究应聚焦于四个关键方向：（i）探究转座子和表观遗传机制在咖啡种质差异基因表达中的作用；（ii）通过RT-qPCR确认表达分析并进行候选基因功能验证；（iii）注释和表征小粒咖啡基因组中未知基因的显著部分；（iv）深入解析Sf的主要突变机制，以实现花发育和开花同步化的精确分子控制，优化咖啡生产。
