利用光合作用产生的乙酸盐构建合成菌群用于异养生产1-丁醇

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Synthetic consortia towards photosynthetically derived acetate for heterotrophic production of 1-butanol

　　

合成菌群是生物技术中的一个新兴领域，具有分工协作和降低污染风险等优势。结合光养细菌和异养细菌的菌群很有吸引力，因为光养细菌可以利用CO2和光能维持生长。已有几项研究探索了此类系统，其中最常使用的碳源是蔗糖。另一种选择是乙酸盐，这是一种较小的二碳分子，由许多微生物（包括模式蓝细菌集胞藻Synechocystis PCC 6803（以下简称Synechocystis））作为副产物产生。尽管在光养生长过程中乙酸盐产量通常较低，但先前的研究表明，代谢工程——特别是引入磷酸酮酶（phosphoketolase, PK）和过表达磷酸转乙酰酶（phosphotransacetylase, Pta）——使得开发出一种能够向培养基中分泌大量乙酸盐的高产菌株（WT_PKPa_RBS_BsPta_Δacs）成为可能（Roussou和Lindblad 2026）。在本研究中，研究人员对大肠杆菌Escherichia coli和台湾假单胞菌Pseudomonas taiwanensis进行了工程改造，使其能够生产工业相关的散装化学品1-丁醇，并以乙酸盐为唯一碳源进行培养。随后，将这些菌株分别与之前改造过的Synechocystis菌株WT_PKPa_RBS_BsPta_Δacs共培养，形成两个不同的菌群，并维持了42天。成功监测了生长动态，且菌群中的乙酸盐浓度低于相应的纯种Synechocystis培养物。同时，在两个共培养体系中检测到了1-丁醇的产生，证明了将光合作用衍生的乙酸盐与异养生产高附加值散装化学品耦合的可行性。

研究背景与意义

自然界中普遍存在微生物群落，其成员间可建立互利共生、偏利共生、寄生或中性关系等多种相互作用。合成菌群（synthetic consortia）是生物技术领域的新兴方向，通过在不同菌株间分配劳动分工，可以减轻单个菌株的代谢负担，提高系统稳定性，并增强抗污染能力。光养-异养合成菌群因其独特的优势而备受关注：光养微生物如蓝细菌（cyanobacteria）能够利用光能和CO₂合成有机碳化合物，为异养微生物提供碳源，而异养微生物则可利用这些碳源生产高价值化学品。以往研究多采用蔗糖作为碳源，但乙酸盐作为一种更小的二碳分子，同样是许多微生物（包括模式蓝细菌集胞藻Synechocystis PCC 6803）天然代谢的副产物。然而，野生型Synechocystis的光养乙酸盐产量通常很低。此前，研究人员通过引入异源磷酸酮酶（phosphoketolase, PK）和过表达磷酸转乙酰酶（phosphotransacetylase, Pta），成功构建了高产乙酸盐的Synechocystis菌株WT_PKPa_RBS_BsPta_Δacs，该菌株在摇瓶培养中乙酸盐产量可达2.7 g/L。基于此，本研究旨在探究能否利用该光合蓝细菌产生的乙酸盐，作为碳源供给经工程改造的大肠杆菌Escherichia coli和台湾假单胞菌Pseudomonas taiwanensis，以实现从CO₂到工业大宗化学品1-丁醇的太阳能驱动生物合成。该研究发表在《Applied Microbiology and Biotechnology》上。

主要关键技术方法

1. 1.
   菌株工程改造：利用合成生物学方法，将源自脂肪酸生物合成的O₂耐受性1-丁醇途径TPC4（包含酰基-ACP硫酯酶Aat、羧酸还原酶Car和醛还原酶Adh）克隆至广宿主载体pPMQAK1中，并在不同启动子（硫解酶启动子Pthl和合成启动子Pem7）驱动下，分别转化至E. coli BL21 DE3和P. taiwanensis VLB120中，获得产1-丁醇的工程菌株E. coliPem7_ButOH和P. taiwanensisPem7_ButOH。
2. 2.
   适应性实验室进化（Adaptive Laboratory Evolution, ALE）：将工程化异养菌在含有递减浓度乙酸盐（从2 g/L逐步降至0.5 g/L）的优化BG11培养基（CoBG11）中进行反复传代培养，以提升其在乙酸盐为唯一碳源条件下的生长适应性和稳定性。
3. 3.
   合成菌群长期共培养实验：将高产乙酸盐的Synechocystis菌株WT_PKPa_RBS_BsPta_Δacs分别与两种工程化异养菌按初始OD₇₅₀:OD₆₀₀ = 5:1的比例接种于封闭系统中，在光照65 μmol photons m^-2s^-1、温度30°C条件下共培养42天。定期取样（每2天或4天）替换新鲜培养基并调节pH至7，通过活菌计数（CFU/mL）、叶绿素a提取测定、气相色谱（GC）和核磁共振（NMR）等方法监测各菌群生长动态、乙酸盐消耗及1-丁醇产量。

研究结果

1. 大肠杆菌能以乙酸盐为碳源生长并生产1-丁醇

研究发现，在CoBG11培养基中添加不同浓度乙酸钠（SoAc）时，E. coli_Pthl_ButOH的生长情况显示，乙酸盐浓度越低，菌株生长越好。在所有测试条件下均检测到1-丁醇产生，其中添加2 g/L和4 g/L乙酸盐的条件在培养后期（第11和13天）表现出较高的体积产量。当产量按OD归一化后，以乙酸盐为碳源的培养物显示出比富集LB培养基更高的单位细胞产量。

2. 通过重复培养增强大肠杆菌和台湾假单胞菌在低浓度乙酸盐下的生长与1-丁醇生产

使用更强启动子Pem7改造后的菌株E. coliPem7_ButOH和P. taiwanensisPem7_ButOH在含2 g/L SoAc的CoBG11中培养6天后发现，P. taiwanensis_Pem7_ButOH生长更好，乙酸盐消耗更稳定，且其1-丁醇产量在两种培养基中相似。经过五轮适应性进化后，两菌株在1 g/L和0.5 g/L SoAc条件下的生长显著改善，OD₆₀₀值接近0.5，乙酸盐在两天内被快速耗尽。尽管1-丁醇产量未超过适应前水平，但在0.5 g/L SoAc条件下仍能稳定检测到产物，表明菌株已适应低浓度乙酸盐环境。

3. 构建基于乙酸盐的大肠杆菌或台湾假单胞菌与产乙酸蓝细菌的合成菌群以实现光合驱动的1-丁醇生产

将适应性进化后的E. coliPem7_ButOH和P. taiwanensisPem7_ButOH分别与高产乙酸盐的Synechocystis菌株WT_PKPa_RBS_BsPta_Δacs共培养42天。结果显示：

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  异养菌生长方面：E. coli菌群在前10天细胞数量不稳定，之后逐渐增长并在第30天后缓慢下降；P. taiwanensis菌群在前6天波动后趋于稳定，但其细胞密度整体低于E. coli菌群。
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  蓝细菌生长方面：共培养体系中Synechocystis的叶绿素a浓度在第2-6天增加，随后进入平台期并于第20天后下降。与P. taiwanensis共培养的菌群中叶绿素a浓度始终高于与E. coli共培养的菌群，且在多个时间点差异显著。
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  乙酸盐浓度方面：纯种Synechocystis培养物中的乙酸盐浓度在整个实验中持续最高，而两个共培养体系中的乙酸盐浓度均显著更低，表明异养菌有效利用了光合产生的乙酸盐。
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  1-丁醇产量方面：在两个共培养体系中均检测到了1-丁醇的产生。虽然产量不稳定且总体水平较低，但在特定时间点（如E. coli菌群在第10和14天，P. taiwanensis菌群在第20和26天）出现了相对较高的产量峰值。

总结与讨论

本研究证实，通过工程改造的Synechocystis菌株光合固定CO₂产生的乙酸盐，可以作为工程化E. coli和P. taiwanensis的唯一碳源，并支撑其合成1-丁醇。尽管1-丁醇的绝对产量较低，但该研究首次展示了基于乙酸盐作为中间碳载体的光养-异养合成菌群的可行性，为从CO₂出发可持续生产大宗化学品提供了新的概念验证。讨论指出，乙酸盐被异养菌利用主要通过乙酰辅酶A合成酶（Acs）途径（消耗2 ATP）或乙酸激酶（AckA）-磷酸转乙酰酶（Pta）途径（消耗1 ATP）转化为乙酰辅酶A。1-丁醇产量受限的可能原因包括：乙酸盐同化过程耗能但未能增加还原力NAD(P)H的供应；在碳限制条件下，脂肪酸合成途径可能被下调，从而限制了通过TPC途径流向1-丁醇的碳通量。此外，P. taiwanensis的1-丁醇产量在不同条件下保持稳定，表明其生产能力与生长关联不大，更多依赖于脂肪酸途径的碳可用性。未来可通过进一步优化代谢途径、提高乙酸盐产量和改善菌群稳定性来提升目标产物得率。