一种不依赖诱导剂的单质粒 CRISPR-Cas9 系统，用于芽孢杆菌属物种的基因组编辑

《Applied Microbiology and Biotechnology》：An inducer-independent, single-plasmid CRISPR-Cas9 system for genome editing in Bacillus species

　　

摘要

分子生物学工具的进步对于简化和加速工业及学术应用中的细胞基因工程至关重要。虽然 CRISPR-Cas 提高了基因组编辑效率，但当前系统存在局限性且通常具有宿主特异性，这限制了它们的通用性。本研究描述了一种通用的 CRISPR-Cas9 系统，用于在具有工业价值的Bacillus物种中进行基因组编辑。通过改良成熟的基于 pJOE8999 载体的 CRISPR-Cas9 基因组编辑系统，我们构建了一种无需诱导剂、广宿主范围的基因组编辑系统。该系统保持了对目标细胞和克隆宿主低毒性的优点，以及单质粒 CRISPR-Cas9 系统的易用性。我们利用Bacillus保守veg基因的组成型 Sigma70 型启动子，开发并测试了不同强度启动子变体用于 Cas9 表达的适用性。在三种不同的Bacillus物种中成功实现基因缺失，证明了该改良系统在这一具有工业重要性的属中的通用性。通过在Bacillus licheniformis基因组中整合报告基因融合体和引入单点突变，进一步证实了这一点。本研究开发的这一单步基于 CRISPR 的转化方案，实现了快速基因组编辑工作流程，且动手操作时间最少。

关键点

• 编辑和筛选启动子变体，以实现芽孢杆菌属中 Cas9 表达的平衡。

• 开发了一种通用的、无需诱导剂的、单质粒 CRISPR-Cas 系统。

• 验证了改良的 CRISPR 系统在不同芽孢杆菌中用于基因组编辑的有效性。