《Analytical Methods》：Microsampling of proteins from biological matrices: sampling methods and devices, typical workflows, clinical examples, novel applications and innovationsOpen Access
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在生物分析中，微量采样已发展成为传统血液采样的有前景的替代方案，这在基于质谱的蛋白质分析中同样适用。过去10–15年间，采样技术和液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术的发展将该领域从新生儿筛查中使用的纸上干血斑采样扩展至多种采样装置，应用范围涵盖低丰度生物标志
在生物分析中，微量采样已发展成为传统血液采样的有前景的替代方案，这在基于质谱的蛋白质分析中同样适用。过去10–15年间，采样技术和液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术的发展将该领域从新生儿筛查中使用的纸上干血斑采样扩展至多种采样装置，应用范围涵盖低丰度生物标志物监测、生物制药的治疗药物监测（TDM）、反兴奋剂分析以及多组学研究。本综述概述了基于LC-MS的干燥微量样品蛋白质分析在近期（2021–2026年）的进展。研究人员首先将干燥微量采样与传统血液采样进行比较，然后描述不同的干燥微量采样装置及其发展，并重点介绍来自不同生物基质中的应用。典型的蛋白质分析工作流程结合近期文献中的实例进行阐述，涵盖从样品提取、自下而上（bottom-up）和自上而下（top-down）工作流程到靶向和非靶向分析的所有步骤，同时介绍标准化方法和自动化技术。研究人员详细讨论了几个近期临床实例和新颖应用，涵盖治疗性单克隆抗体（t-mAb）监测、多重生物标志物测定、蛋白质组谱分析和多组学研究。研究人员还介绍了近期两项创新：为现场采样开发的干血免疫测定，以及将样品制备步骤（蛋白水解和免疫亲和）整合到采样过程中的智能采样。最后，研究人员讨论了技术成熟度以及临床转化所面临的剩余障碍。
2 干燥微量采样：从纸上血滴到体积采样与即时血浆分离
2.1 微量采样与常规样品的比较
微量采样相较于常规生物样品采样具有多项优势。干燥微量样品与常规血浆和血清样品之间的一个主要差异在于实际样品基质。血浆和血清通过静脉穿刺后从全血制备，而干燥微量样品如干血斑（DBS）则通过滴加并干燥毛细血管血滴制备。从静脉采集的血浆或血清样品转向干燥毛细血管全血，在样品制备和结果解读方面均带来挑战。大多数生物标志物参考水平和药物治疗水平已在血浆或血清中建立，因此从干燥微量样品测得的值需要进行换算，或需为此基质建立新的参考水平或治疗水平。Gao等人通过比较从猴子采集的三种样品基质中测得的治疗性单克隆抗体（t-mAb）浓度对此进行了说明：静脉血清、施加于体积吸收/精确微量采样（VAMS）装置的静脉全血以及施加于VAMS的毛细血管全血。静脉血清显示的水平显著高于两种全血样品，而静脉或毛细血管全血之间未见显著差异。在此案例中，血清与全血作为基质存在差异，这可归因于全血中血细胞导致的血清体积差异，而静脉与毛细血管全血之间未见差异。然而，这可能因分析物而异，在转向干燥微量样品之前需要进行调查和验证。
2.2 装置与发展概述
在传统DBS采样中，将一滴血沉积在纸上，干燥后冲出圆形部分（通常直径为3或6 mm）并进一步处理。干燥前血液在纸上扩散，扩散程度及干燥斑面积取决于血液红细胞压积。斑面积随红细胞压积增加而减小，因此冲取斑中血液体积将因所采集血样的红细胞压积而异。由于此原因，低红细胞压积样品中的分析物浓度可能被低估，高红细胞压积样品中则可能被高估。为解决红细胞压积效应的潜在问题，已引入体积采样装置。首批用于干燥微量采样的体积采样装置VAMS和HemaSpot于2014年推出，此后多种其他体积装置进入市场。具有血浆分离膜的体积装置如Telimmune血浆分离卡（原Noviplex）和Capitainer SEP10旨在无需离心即可产生血浆，简化干燥样品基质并使其更接近静脉血浆或血清样品。大多数近期出版物使用传统纸基DBS卡和VAMS进行采样。传统纸基DBS卡通常由高吸收性纯纤维素滤纸制成。VAMS由亲水性聚合物组成，能够采集10、20或30 μL的确定体积血液。Capitainer B10利用微流控技术采集精确体积（10 μL）的血液，并具有内置指示器确认采样成功。具有血浆分离膜的装置如Capitainer SEP10和Telimmune简化了干燥微量样品并减轻了静脉血样与干燥微量样品之间的差异。Capitainer SEP10产生2 × 10 μL的细胞分离血液，Telimmune Uno和Duo分别产生1 × 3 μL或2 × 3 μL。大多数已发表的LC-MS蛋白质分析论文使用传统DBS，原因包括成本较低以及该技术可用时间更长。具有血浆分离装置的设备价格较高，可能成为常规分析广泛使用的障碍。
2.3 样品基质
尽管最初为干血采样开发，其他生物基质如血浆、血清、尿液和唾液也可使用干燥微量采样。这通常是因为干燥样品便于运输和储存，包括降低生物危害和提高分析物稳定性。在某些情况下，全血以外的基质可能更可取，例如小细胞肺癌标志物胃泌素释放肽前体（ProGRP）无法在全血中可靠测定。使用血浆或血清而非全血的额外优势在于静脉血浆和血清中的参考水平通常可用。尿液和唾液是易于获取的基质。大多数可用出版物描述毛细血管血的使用，有限数量的应用描述了血清、血浆、尿液和唾液的干燥微量采样。当用于全血以外的基质采样时，样品基质需先在单独容器中收集，然后施加到微量采样装置上。因此，其他基质的微量采样不如毛细血管全血采集简单，血浆和血清的自采样不可行。
3 分析工作流程：从干燥微量样品到基于LC-MS的蛋白质分析
样品制备仍是蛋白质生物分析中的主要瓶颈。在基于微量采样的LC-MS工作流程中，无论微量采样器类型或分析肽段还是完整蛋白质，若干核心步骤是共通的，包括初始处理步骤、提取或去除基质组分，以及可选的净化或富集。
3.1 微量采样
初始步骤取决于微量采样格式。对于纸基装置如DBS，样品制备通常从冲出采样区域的确定部分开始。相比之下，体积装置如VAMS通常可直接进行后续样品制备。
3.2 提取与洗涤
蛋白质提取通常通过将微量样品悬浮在碳酸氢铵或Tris-HCl等溶液中进行的。为增强蛋白质回收率，常添加去氧胆酸钠（SDC）、十二烷基硫酸钠（SDS）、Triton X-100或酸不稳定表面活性剂如RapiGest等去污剂。一些方案使用相对较短的提取时间，另一些则在低温下过夜孵育以优化提取。在某些工作流程中，在提取前应用初始洗涤步骤以去除高丰度可溶性蛋白质如白蛋白。洗涤可去除高丰度干扰基质蛋白，留下复杂度较低的样品，从而改善下游步骤。
3.3 净化与富集
为进一步降低样品复杂度，采用多种净化与富集策略。免疫亲和捕获是使用最广泛且最特异的方法，通过抗体包被磁珠或蛋白G珠分离靶蛋白或肽段。对于低丰度靶标，常采用SISCAPA（稳定同位素标准与抗肽抗体捕获）方法，使用抗肽抗体选择性富集消化后产生的蛋白特征肽段，与蛋白水平捕获相比具有更高灵敏度和更干净的提取物。其他策略包括分级分离方法，如将全血分离为可溶性和膜相关蛋白组分，或应用多相提取。
3.4 内标与归一化
大多数工作流程采用校正策略以校正样品制备、仪器响应和基质效应中的变异性。稳定同位素标记（SIL）肽段是靶向LC-MS定量中最常用的方法。更先进的策略包括在消化前添加具有胰蛋白酶可切割延伸的可切割SIL肽段，以校正酶解效率。当SIL标准品不可用或在发现工作流程中，归一化可能依赖于高丰度内源蛋白。完整蛋白质也可用作结构类似物作为内标。在无标记DIA-LC-MS/MS工作流程中，归一化通常使用归一化强度谱或保留时间依赖性跨运行归一化进行计算实现。
3.5 自下而上和自上而下工作流程
自下而上和自上而下工作流程在初始步骤上共享，但存在根本差异。自上而下方法通常更简单，因为分析完整蛋白质，而蛋白水解消化是自下而上工作流程中的决定性步骤。
3.5.1 自下而上
大多数基于微量采样的蛋白质分析依赖自下而上蛋白质组学。典型工作流程包括消化前制备、酶消化和消化后净化与分析。消化前步骤通常包括变性、还原和烷基化。尿素是最常用的变性剂，二硫键使用三(2-羧乙基)膦（TCEP）或二硫苏糖醇（DTT）还原，随后用碘乙酰胺等试剂烷基化。蛋白水解消化最常使用胰蛋白酶进行，有时与Lys-C联合使用以提高消化效率。消化通常在37 °C下进行2–18小时。消化后通过酸化淬灭反应，然后使用固相萃取（SPE）进行纯化和脱盐。
3.5.2 自上而下/完整蛋白质分析
自上而下工作流程分析完整蛋白质或大片段，通常用于表征蛋白型或糖型。除提取、富集和净化等共享步骤外，自上而下工作流程相对简单。例如，完整α1-酸性糖蛋白已通过简单提取和稀释步骤后使用nanoLC-MS或毛细管电泳-质谱从DBS分析。表面采样毛细管电泳-质谱（SS-CE-MS）可实现从组织或干燥生物流体的确定区域直接提取蛋白质。自上而下工作流程通常更快且劳动强度更低，但产生显著更复杂的谱图，使解读比肽段水平数据更困难。
3.6 LC-MS分析与采集模式
LC-MS配置和采集策略的选择代表了灵敏度、稳健性、通量和重现性之间的重要平衡。大多数配置可按分离规模（常规流速、微流速、纳流速）和采集策略（靶向与非靶向）分类。常规流速和微流速LC有利于稳健的高通量靶向分析，而纳流速LC主要用于发现蛋白质组学。靶向蛋白质分析最常使用三重四极杆仪器在MRM/SRM模式下进行。对于较低丰度靶标，使用纳流速LC-MRM/SRM增强灵敏度。平行反应监测（PRM）在高分辨仪器上提供靶向定量，同时保留高分辨前体和碎片离子信息。非靶向蛋白质组学主要依赖高分辨质谱结合纳流速LC，数据依赖采集（DDA）和数据非依赖采集（DIA）均被使用，DIA通常提供更好的重现性。离子淌度方法如PASEF或FAIMS也用于增强灵敏度和分离。
3.7 自动化
为提高通量和重现性，多项研究纳入部分或全自动样品制备工作流程。自动化已应用于样品处理、提取、还原、烷基化、消化、净化和LC-MS样品处理，使用机器人液体处理平台和磁珠处理。例如，Nakajima等人开发了用于DBS高通量新生儿筛查的auto-NANDA流程，可鉴定超过5000种蛋白质。
4 近期临床实例与新颖应用
4.1 靶向蛋白质分析
大多数可用出版物描述靶向分析。一个主要生物制药类别是t-mAbs。Chi等人描述了从VAMS采集的20 μL血液中定量三种t-mAb曲妥珠单抗、帕博利珠单抗和贝伐珠单抗的方法。样品制备使用托珠单抗作为替代内标，通过蛋白G珠分离IgG和t-mAbs，然后在60 °C下进行1小时相对较短的消化。平行VAMS样品和血浆样品分析显示所有三种分析物具有良好的相关性，相关系数大于0.994。该方法还应用于接受三种药物治疗的患者临床样品。靶向蛋白质分析也可高度多重化。Richard等人描述了从DBS样品中检测319个肽段对应250种蛋白质的多重MRM方法，包括与血液兴奋剂操作相关的蛋白质。该方法应用于10名健康运动员志愿者的140天纵向临床研究，大多数靶蛋白在所有研究样品中均可定量，表明个体靶向血液蛋白质组随时间稳定且具有个体特异性。
4.2 非靶向分析
非靶向蛋白质分析或蛋白质组谱分析通常用于发现疾病或健康状态的分子特征。Baik等人描述了VAMS样品蛋白质组谱分析装置，用于发现COVID-19长期精神科后遗症（PASC）幸存者的分子特征。他们分析了51名COVID-19幸存者的样品，使用SWATH-MS分析，共定量1604种蛋白质。多变量分析显示三组分离，表明长新冠中的精神科组分与免疫、葡萄糖和脂质代谢通路改变以及神经炎症和神经退行性变有关。Foster等人描述了未富集蛋白质组、N-糖肽和磷酸肽的联合分析，应用于坦桑尼亚38名脓毒症患者。血液采集在VAMS上，共定量2078个蛋白质组、4200个糖肽和4430个独特磷酸化位点。Shen等人通过分析干血中数千种代谢物、脂质、细胞因子和蛋白质，并结合可穿戴传感器数据，研究了生活方式相关的健康变化。在一项24/7研究中，一名参与者在7天内清醒时间每1–2小时采集血液微量样品，通过智能手表监测心率、步数和睡眠，通过连续血糖监测监测血糖。共进行了214661项生化测量，展示了高频采样在个性化个体随访和疾病监测中的前景。
5 装置创新/发展
5.1 干血免疫测定
近年来，基于纸基微流控装置的LC-MS蛋白质测定领域出现了有趣的创新。Badu-Tawiah课题组的研究集中于使用离子探针的微型质谱仪进行快速现场诊断。他们开发了通过检测恶性疟原虫富组氨酸蛋白-2（PfHRP-2）诊断疟疾的免疫测定。该创新的核心是将捕获抗体固定在纸上，与样品孵育后捕获PfHRP-2，然后添加修饰有小分子离子探针的报告抗体，通过纸喷雾电离耦合质谱仪测量该探针的裂解产物。他们为此开发了多层和单层装置，展示了现场快速诊断的潜力。
