负载肉桂醛的金纳米双锥用于双重放大氧化应激以增强癌症催化治疗

《Biomaterials Science》：Cinnamaldehyde-loaded gold nanobipyramids for dual-amplification of oxidative stress to enhance cancer catalytic therapyOpen Access

　　

已开发多种无机纳米酶，通过模拟酶的催化活性产生高反应性羟基自由基(˙OH)，用于催化治疗。然而，肿瘤细胞中升高的抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)水平可有效中和˙OH，从而削弱这些纳米酶的治疗效果，这是催化治疗中的常见问题。在本研究中，研究人员通过静电吸附和氢键将金纳米双锥(GNB)与肉桂醛(CA)整合，构建了一种能够肿瘤特异性增强氧化应激的纳米酶平台(GNB@CA)。GNB具有内在的过氧化物酶(POD)样活性，可将内源性过氧化氢(H₂O₂)转化为高毒性˙OH用于催化治疗。此外，其光热转换能力进一步增强催化效率。CA通过双重机制发挥作用：其α,β-不饱和醛基通过迈克尔加成反应与GSH的巯基共价结合，导致细胞内GSH减少，从而削弱肿瘤细胞的抗氧化防御。同时，CA通过降低线粒体膜电位诱导线粒体功能障碍，进而触发肿瘤细胞凋亡。体内研究表明，GNB@CA可通过协同诱导强烈的氧化应激有效根除小鼠三阴性乳腺癌(TNBC)。该研究为催化癌症治疗中纳米酶的设计提供了有价值的见解。

三阴性乳腺癌（TNBC）是最具侵袭性的乳腺癌亚型，约占所有乳腺癌病例的15%–20%，预后极差。传统化疗药物（如紫杉醇、蒽环类）缺乏肿瘤特异性，导致正常组织脱靶毒性，且肿瘤易产生耐药性。因此，开发新型高效的治疗策略具有重要的临床意义。研究表明，代谢重编程使TNBC细胞内过氧化氢（H₂O₂）水平升高，但细胞同时增强以谷胱甘肽（GSH）为核心的抗氧化防御系统，将活性氧（ROS）维持在促进增殖而非凋亡的水平，从而支持肿瘤快速生长。针对此特征，已有研究尝试抑制GSH合成或直接消耗GSH，但单一策略常因肿瘤代偿性适应而受限。因此，需设计整合多种机制的创新疗法。纳米酶（具备酶样催化活性的纳米材料）可催化肿瘤微环境（TME）中内源性H₂O₂生成高毒性羟基自由基（˙OH），但GSH可有效中和˙OH，导致疗效降低。肉桂醛（CA）作为一种天然活性分子，可通过迈克尔加成消耗GSH，并诱导线粒体功能障碍。基于上述考虑，研究人员将具有过氧化物酶（POD）样活性的金纳米双锥（GNB）与CA结合，构建了GNB@CA纳米平台，以协同放大氧化应激，用于增强癌症催化治疗。该研究发表于《Biomaterials Science》。

研究人员采用种子介导生长法合成裸GNB，经SH-PEG_5k-COOH修饰后，通过静电吸附和氢键负载CA。利用透射电子显微镜（TEM）、紫外-可见光谱（UV-vis）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、动态光散射（DLS）等手段表征材料性质；通过CCK-8、共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）、流式细胞术、转录组测序等评估体外抗肿瘤机制；体内实验采用BALB/c小鼠皮下接种4T1鼠乳腺癌细胞模型（动物实验经广东医科大学实验动物中心批准），评估生物分布、光热效应及抗肿瘤效果。主要技术方法包括材料合成与表征、GSH消耗检测、POD样活性验证、细胞摄取与凋亡分析、线粒体功能评估、转录组学分析以及体内荧光成像和组织病理学检查。

结果与讨论部分包含以下小标题：

（1）GNB@CA的设计与表征：TEM显示GNB@CA为均匀分散的纳米双锥；UV-vis光谱在770 nm、520 nm和340 nm处出现特征吸收峰，证实CA成功负载；FTIR证实氢键和静电相互作用，CA结构保持完整。DLS和zeta电位进一步确认CA吸附。载药量（DL%）约28.93%，包封效率（EE%）约36.04%。在pH 5.5下CA释放率显著高于pH 7.4（29.66% vs 13.63%），表明酸性TME响应性释放。GNB@CA在多种介质中7天内保持良好胶体稳定性。光热实验显示，在808 nm激光照射下GNB@CA表现出浓度和功率依赖的升温，光热转换效率（η）达58.88%，且经5次加热-冷却循环后仍稳定。

（2）GNB@CA的GSH消耗与ROS生成效应：利用DTNB显色法证明GNB@CA可随时间消耗溶液中GSH，12 h后GSH含量显著降低。以TMB为底物，发现GNB@CA能催化H₂O₂产生˙OH，反应速率随GNB@CA、H₂O₂和TMB浓度增加而加快。催化活性呈pH依赖性：pH 5.5 > pH 6.0 > pH 7.4，且pH 5.5活性约为pH 7.4的3倍，表明肿瘤微环境选择性激活。电子顺磁共振（EPR）证实˙OH产生。CA负载不影响GNB的POD样稳定性。

（3）GNB@CA的体外细胞摄取与细胞毒性：CLSM显示Cy5.5标记的GNB@CA随时间逐渐被4T1细胞内化，初期定位于溶酶体，8 h后逃逸至细胞质；流式细胞术定量显示8 h内荧光强度增加约41.6%。CCK-8实验表明，GNB@CA联合激光照射使细胞活力降至20%以下。活/死染色和Annexin V-FITC/PI凋亡分析进一步证实，GNB@CA + NIR组晚期凋亡细胞比例达25.3%，显著高于其他组。

（4）GNB@CA与线粒体损伤的相关性：转录组分析显示GNB@CA + NIR处理后鉴定出1988个差异表达基因（1645个上调，343个下调）；GO和KEGG富集分析表明谷胱甘肽代谢等通路显著富集。细胞内GSH水平在CA和GNB@CA处理后显著降低，激光照射进一步加剧GSH消耗。H₂O₂检测显示CA组H₂O₂升高，而GNB@CA组H₂O₂降低。DCFH-DA探针显示GNB@CA组ROS荧光显著增强。MitoTracker Green和JC-1染色显示GNB@CA处理后线粒体信号减弱、线粒体膜电位（MMP）去极化，表明线粒体损伤。

（5）GNB@CA的体内生物分布：在4T1荷瘤小鼠中，Cy5.5标记的GNB@CA在肿瘤部位滞留达24 h，显著高于游离Cy5.5组，归因于EPR效应。主要器官离体荧光分析未显示特异性蓄积。光热成像显示注射GNB@CA后肿瘤温度在5 min内升至42 °C，满足温和光热增强催化条件。溶血实验表明GNB@CA无溶血现象，血液相容性良好。

（6）GNB@CA的体内抗肿瘤效果：在皮下4T1肿瘤模型中，GNB@CA和GNB@CA + NIR显著抑制肿瘤生长，肿瘤体积保持接近或低于初始水平，而对照组肿瘤体积增大3倍以上。H&E、TUNEL、Ki67、caspase-3和Bcl-2染色表明GNB@CA + NIR组凋亡标志物显著升高，增殖标志物降低。主要器官H&E染色未见明显病理损伤，血清肝肾功能指标正常，表明治疗安全性良好。

讨论部分指出当前研究的局限性：14天观察期不足以进行生存分析；长期生物安全性需进一步评估；免疫相关毒性未系统研究；仅使用单一4T1细胞系，结果普遍性有待验证。未来计划在更多肿瘤模型和患者来源模型中评估，并探索与免疫检查点抑制剂联用。

结论部分：研究人员构建了GNB@CA，一种线粒体损伤诱导剂，由具有酶样活性的金纳米双锥和GSH消耗剂肉桂醛组成。该纳米平台协同整合ROS生成与GSH消耗以增强治疗效果。在生物体内，GNB@CA通过EPR效应优先蓄积于肿瘤组织，促进ROS产生并破坏线粒体完整性；同时，GSH消耗进一步加剧该过程，在肿瘤细胞内建立不可逆的氧化应激环境。该策略展示了线粒体靶向作为癌症治疗可行创新方法的潜力。未来工作将扩展到更广泛的癌症模型和患者来源系统，并探索与免疫检查点抑制剂的协同作用。