定制化pH响应性聚氨酯基制剂治疗慢性皮肤创面炎症并促进组织再生

《Biomaterials Science》：Customized pH-responsive poly(urethane)-based formulations treating chronic skin wound inflammation and promoting tissue regenerationOpen Access

　　

严重炎症和感染是导致创面慢性化的主要因素。尽管已有多种创面敷料被设计用于局部递送治疗药物，但缺乏患者个性化仍是限制因素。为此，本研究旨在通过结合刺激响应性材料和3D生物打印，建立一种适应性治疗策略，用于前瞻性制造形状个性化贴片，并使其能够根据感染创面渗出液的碱性来调节药物释放。首先，研究人员合成了一种含–COOH的两亲性聚醚氨酯，并用于配制热/碱性pH响应性水凝胶；同时选择人重组乳铁蛋白（hrLF），因其具有天然来源的治疗特性。随后，通过流变学评估了载hrLF水凝胶的热响应性，并通过紫外-可见光谱和比色法评估了hrLF对慢性创面生物侵袭性环境的适应性。此外，研究人员观察到通过非Fickian扩散机制实现的pH响应性精细调控药物释放。并且，在简化炎症创面的体外研究中，hrLF促进了人真皮成纤维细胞增殖（DNA含量增加），发挥了抗炎作用（降低TNF-α、IL-1β和IL-6的表达），并对金黄色葡萄球菌表现出抑菌活性。最后，载hrLF水凝胶显示出作为生物墨水具有良好的可加工性。总体而言，所设计的系统展现出对动态创面环境的强适应性。

慢性皮肤创面迁延不愈的核心原因在于持续炎症和感染。正常愈合过程中炎症阶段受控，但若活性氧（ROS）和促炎介质过度产生，可导致细胞外基质损伤和巨噬细胞极化失常，形成自我维持的慢性炎症。目前常用创面敷料多仅作为药物载体，存在释放不可控和缺乏患者个性化的问题。乳铁蛋白是一种天然免疫调节蛋白，兼具抗炎和抗菌活性，但在慢性创面的恶劣环境中稳定性有限。针对这些问题，研究人员设计了一种结合刺激响应材料与3D生物打印的策略：以自合成的含羧基两亲性聚醚氨酯（PEU）为基材，构建热/碱性pH响应水凝胶，负载人重组乳铁蛋白（hrLF），用于根据感染创面渗出液的碱性程度智能调控药物释放。该研究发表在《Biomaterials Science》。

主要关键技术方法如下：通过两步缩聚反应合成聚醚氨酯，并经低温等离子体丙烯酸处理引入羧基；以15% w/v浓度在生理盐水中配制水凝胶；采用流变学测试表征溶胶-凝胶转变；使用紫外-可见光谱和BCA比色法评估hrLF在pH 5–11缓冲液中的稳定性；采用BCA法和酶联免疫吸附测定（ELISA）定量释放，并用Korsmeyer-Peppas模型分析释放机制；依据ISO 10993-5用NIH-3T3鼠成纤维细胞评价水凝胶浸提液细胞相容性；用脂多糖（LPS）刺激的人真皮成纤维细胞（HDFs）模型研究代谢活性、DNA含量及RT-PCR检测炎症/再生基因表达；以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行抗菌试验；最后用3D生物打印机挤出标志物验证可打印性。

P-CHP407化学性质：通过ATR-FTIR光谱、尺寸排阻色谱（SEC）和TBO比色法确认聚合物合成成功，等离子体处理未引起链降解，羧基含量为4.7 × 10¹⁸ ± 5.6 × 10¹⁷个/g。

载hrLF智能水凝胶的热响应性：连续和动态温度扫描显示，hrLF负载未改变凝胶化机制和动力学，溶胶-凝胶转变温度约为28 °C；频率扫描证实37 °C下形成凝胶态（G′ > G″），仅在高分子量蛋白存在时出现稍弱但更发达的凝胶网络。

乳铁蛋白在缓冲液中的行为：UV/Vis和BCA法显示hrLF在pH 5–11、37 °C孵育7天内保持完整性，仅存在轻微pH依赖性溶解度差异；因BCA法灵敏度更高，后续释放研究选用该法。

pH控制下的乳铁蛋白释放：载hrLF水凝胶在pH 5、7、9、11缓冲液中呈现持续释放，且随pH升高释放量增加；24 h释放率分别为5.6% ± 2.2%、9.2% ± 0.9%、11.3% ± 1.0%和16.3% ± 1.7%。Korsmeyer-Peppas模型计算释放指数为0.49–0.61，表明非Fickian扩散机制。ELISA结果在pH 5–9与BCA一致，而pH 11下差异较大，提示该极端碱性条件可能诱导蛋白构象变化。

水凝胶制剂细胞相容性：依据ISO 10993-5，P-CHP407和P-CHP407_hrLF浸提液培养NIH-3T3细胞24 h后，细胞活力>80%，毒性<20%，活/死染色进一步证实无细胞毒性。

药物释放条件下的乳铁蛋白细胞相容性：Alamar Blue法显示10–500 μg mL^?1 hrLF不影响早期代谢活性，培养5天后代谢活性显著升高，500 μg mL^?1时达136.5% ± 3.5%；细胞周期分析显示hrLF未改变细胞周期分布，S期细胞比例略有增加，支持其促增殖作用。

创面模拟条件下乳铁蛋白的促再生和抗炎活性：在LPS预处理的HDFs模型中，hrLF维持并提高细胞活力，增加双链DNA含量，降低TNF-α、IL-1β和IL-6表达；较高浓度hrLF同时降低IL-10表达，并下调III型胶原（COL III）表达，提示其可能通过抑制过度纤维化而促进平衡修复。

乳铁蛋白的抗菌性能：hrLF对金黄色葡萄球菌表现出明显抑菌作用，6 h时菌落数显著下降；对大肠杆菌仅产生短暂抑制作用。该抑菌效应主要归因于铁螯合机制，且革兰氏阳性菌因缺乏外膜而对铁剥夺更敏感。

水凝胶的3D生物打印加工性：以P-CHP407_hrLF为生物墨水，在22 °C半凝胶态挤出、37 °C打印床上逐层沉积，成功复现虚拟模型，证明其具有良好的可挤出性和形状保持能力。

讨论与结论部分指出，该系统能适应动态创面环境，通过pH调控释放、温度控制成型和抗炎/抑菌/促再生作用，为个性化创面敷料提供新思路。研究结论可概括为：目前慢性皮肤创面敷料缺乏患者个性化是阻碍组织愈合的主要限制；本研究构建的多刺激响应聚醚氨酯水凝胶可封装高分子量蛋白质且不改变其热行为，能按临床需要释放hrLF；hrLF在恶劣创面环境中保持构象，并在体外简化炎症创面模型中促进组织再生、减轻炎症和发挥抑菌作用；初步验证了3D打印可成形性，为制造形状个性化敷料奠定了基础。未来研究将聚焦更贴近临床的3D创面模型、工艺放大、GMP合规、灭菌及长期稳定性验证。