《Biomaterials Science》：Conventional and hydrolysable PEGs: comparative evaluation of tissue accumulation, biodistribution and toxicological profileOpen Access
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聚乙二醇（PEG）通常被认为是安全的，并广泛用于制药和个人护理产品中。然而，有关其安全性的担忧源于一些研究，这些研究表明，在接受极高剂量PEG（例如，每周200 mg/kg，持续12周）治疗的动物某些器官中出现了PEG蓄积。尽管这些剂量远高于含PEG药物中PE
聚乙二醇（PEG）通常被认为是安全的，并广泛用于制药和个人护理产品中。然而，有关其安全性的担忧源于一些研究，这些研究表明，在接受极高剂量PEG（例如，每周200 mg/kg，持续12周）治疗的动物某些器官中出现了PEG蓄积。尽管这些剂量远高于含PEG药物中PEG的剂量（高出200–100000倍），但如果聚合物在蓄积后未被清除，这些担忧对于慢性治疗而言可能仍然成立。在本研究中，除了研究PEG蓄积/消除现象及其对治疗动物全血细胞计数、血浆生化和行为表现的影响外，研究人员还研究了新型可水解PEGs（HyPEGs），以减少PEG蓄积。HyPEGs含有可裂解的连接子，在体内水解后，聚合物分子量减半。研究人员评估了20和40 kDa常规PEGs对THP1细胞中巨噬细胞表型的体外影响，以及一系列20和40 kDa常规和可水解PEGs（包括线性和支链结构）的潜在体内毒性、生物分布以及肝、肾、脾、脉络丛、心和肺中的液泡化情况。给药方案为每周两次，持续12周，高剂量为每周200 mg/kg，随后进行8周洗脱期（不给予PEG）。研究表明，巨噬细胞对PEG的内化导致分子量依赖性的细胞反应。在体内，所有PEGs均蓄积于肝、脾、肾和脉络丛中，总体上HyPEGs的蓄积程度较轻。8周洗脱期使大多数器官中蓄积的PEG得以清除，但肾脏除外，这可能是因为肾脏是PEG消除的终端器官。总体而言，通过分析生化和血液学参数，所有PEGs均未显示出血液毒性。脉络丛中存在细胞质PEG阴性液泡，提示适应性细胞反应，但未观察到神经毒性迹象。研究结果表明，尽管不同PEGs在体外引发了不同的巨噬细胞反应，但所有可水解PEGs在体内均显示出有限的组织蓄积且无毒性迹象，凸显了其安全性。
论文解读
一、研究背景与问题提出
聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是一种应用极为广泛的高分子聚合物，在制药和个人护理产品中大量使用。PEG在药物中可呈现三种形式：作为活性成分、作为辅料，或以共价连接方式修饰治疗性分子（多为生物技术来源的蛋白质），以改善其药代动力学特征或降低免疫原性。PEG长期以来被认为具有安全性，但近年来出现了两方面担忧：一是人群中存在抗PEG抗体，可能影响含PEG药物的疗效或诱发过敏反应；二是PEG在部分器官中蓄积的潜在风险。已有研究表明，高剂量PEG给药（如每周200 mg/kg，持续12周）可在动物某些器官中引起蓄积和细胞质液泡化，尽管这些剂量远高于含PEG药物的实际治疗浓度（高出200–100000倍），但对于需要长期给药的慢性治疗而言，如果聚合物蓄积后无法清除，这些担忧仍然值得关注。
既往研究已明确PEG的生物分布和组织蓄积与其分子量密切相关：高分子量PEG（≥40 kDa）倾向于蓄积于脾脏、肾间质和脉络丛并诱导液泡化，而低分子量PEG（10和20 kDa）则倾向于蓄积于排泄器官（肝脏Kupffer细胞、肾小管上皮），液泡化程度极轻或无。然而，降低PEG分子量可能削弱PEG化的优势，因为延长半衰期和保护蛋白质的效果与PEG分子量直接相关。因此，亟需探索既能保持高分子量PEG优势又能减少蓄积的替代策略。
二、研究内容与意义
本研究旨在系统评估常规PEGs和新型可水解PEGs（hydrolysable PEGs，HyPEGs）在体内的蓄积、清除和毒理学特征。HyPEGs含有可裂解连接子，在体内水解后可使聚合物分子量减半，理论上应降低液泡化风险。研究首先在体外考察了20和40 kDa常规PEGs在巨噬细胞中的细胞内转运及其对巨噬细胞表型的影响；随后在体内对20和40 kDa常规及可水解PEGs（包括线性和支链结构）进行了为期12周的高剂量给药（每周200 mg/kg，每周两次尾静脉注射），随后设置8周洗脱期，系统评估了PEG在肝、肾、脾、脉络丛、心和肺中的蓄积情况、细胞质液泡化形成、血液学及血浆生化参数、行为学表现等多维度指标。该研究发表于《Biomaterials Science》期刊，其意义在于首次系统比较了常规PEGs与可水解PEGs在长期高剂量给药下的组织蓄积和毒性差异，为开发更安全的PEG化药物提供了新思路。
三、主要技术方法
研究人员采用了以下关键技术方法：体外实验中，利用人单核细胞系THP-1经佛波酯（PMA）诱导分化为巨噬细胞（MΦ），通过活细胞共聚焦显微镜观察Cy5.5标记PEG与溶酶体探针（LysoTracker）的共定位，采用Pearson相关系数定量共定位程度；通过免疫细胞化学（ICC）检测巨噬细胞表型标志物CD68、CD86和CD163的表达；利用DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧（ROS）水平；利用MitoTracker Orange评估线粒体状态。体内实验中，选用雌性Sprague-Dawley大鼠（6±2周龄，Charles Rivers，意大利），随机分组（治疗组每组8只，洗脱组每组5只），经尾静脉注射给药。采用免疫组织化学（IHC）方法定量检测各器官中PEG阳性面积，采用免疫荧光结合共聚焦显微镜对脉络丛中PEG蓄积和液泡化进行精细分析；通过SDS-PAGE评估HyPEG在体内的水解情况；行为学评估采用旷场实验（open field test）和转棒实验（RotaRod test）。
四、研究结果
4.1 体外研究：PEG在溶酶体中的蓄积诱导THP-1来源巨噬细胞向促炎表型转化
L-PEG20和L-PEG40均能被THP-1来源MΦ巨噬细胞快速内化，并定位于溶酶体中。L-PEG20孵育后巨噬细胞表面促炎标志物CD86表达显著升高，而抗炎标志物CD163表达未受两种PEG影响。两种PEG均未显著改变细胞内ROS水平；L-PEG40（而非L-PEG20）与MitoTracker Orange荧光增强相关。
4.2 体内研究：不同PEG处理对大鼠体重和运动能力的影响
所有PEG处理均未显著影响大鼠体重增长。行为学方面，总体上PEG处理组与对照组无显著差异，但可水解PEG处理组在两项测试中的表现普遍优于至少一个常规PEG处理组：B-PEG40组在转棒实验后期时间点的表现显著低于L-HyPEG40组；L-PEG40组在旷场实验中的穿越次数在洗脱期末显著低于L-HyPEG40组。
4.3 体内研究：不同PEG处理对全血细胞计数和血浆生化的影响
PEG处理对血细胞的影响有限，主要涉及淋巴细胞和单核细胞，且洗脱期后得以恢复。治疗期末，B-PEG40和B4-HyPEG40组白细胞总数显著降低，主要归因于淋巴细胞减少；多数处理组单核细胞数量显著下降（B4-HyPEG40组除外）。洗脱期后这些变化基本恢复。
4.4 体内研究：不同处理对PEG蓄积的影响
免疫组织化学定量显示，所有PEGs均蓄积于肾、肝、脾和脉络丛中。常规PEGs在网状内皮系统器官（肝、脾）中的蓄积呈分子量依赖性，可水解PEGs的蓄积显著较低。洗脱期后，除肾脏外各器官PEG阳性信号均显著下降。肾脏中蓄积的PEG在洗脱后仍显著存在，但L-PEG20和L-HyPEG40组除外，这两组洗脱后肾脏PEG阳性显著降低。B4-HyPEG40在洗脱后肝、脾和脉络丛中仍有明显PEG残留。心、肺中PEG阳性极低。
4.5 体内研究：HyPEG体内水解评估
SDS-PAGE分析表明，从肝和肾裂解物中回收的L-HyPEG40几乎全部已在体内水解，生成分子量为起始聚合物一半的产物（即20 kDa），证实了HyPEG在体内确实发生水解。
4.6 体内研究：不同PEG处理对细胞质液泡化的影响
脉络丛中，L-PEG20定位于PEG阳性液泡中，而其他PEGs主要弥散分布于细胞质中。PEG阳性细胞中存在不同大小的PEG阴性液泡，仅少数大鼠出现少量小的PEG阳性液泡。洗脱期后PEG荧光信号显著下降。体外实验中，仅观察到高分子量常规PEG（L-PEG40）诱导形成小的PEG阳性液泡。
五、讨论与结论
讨论部分指出，PEG在巨噬细胞中的内化引发了分子量依赖性的细胞反应，L-PEG20诱导促炎表型标志物CD86上调，提示PEG蓄积可能激活巨噬细胞的促炎通路。体内研究中，所有PEGs均蓄积于肝、脾、肾和脉络丛，但可水解PEGs的蓄积程度普遍低于常规PEGs，验证了HyPEG设计策略的有效性。8周洗脱期足以清除大多数器官中蓄积的PEG，但肾脏除外，这与肾脏作为PEG消除终端器官的生理角色一致。脉络丛中PEG阴性液泡的存在提示适应性细胞反应，但未观察到神经毒性行为学证据。血液学分析未发现PEG的血液毒性。
研究结论为：尽管不同PEGs在体外引发了不同的巨噬细胞反应，但所有可水解PEGs在体内均显示出有限的组织蓄积且无毒性迹象，凸显了可水解PEGs作为更安全的PEG化药物平台的应用前景。
