《Chemical Science》：Identification of a G-quadruplex-forming cell-free DNA fragment as a biomarker for the precise diagnosis of hepatocellular carcinomaOpen Access
编辑推荐：
肝细胞癌（HCC）的早期检测仍面临挑战，目前推荐的基于超声联合甲胎蛋白（AFP）的监测策略因敏感度和可及性欠佳而受限。游离DNA（cfDNA）为癌症检测提供了一条微创途径。然而，现有大多数基于cfDNA的方法要么在低投入样本中表现不可靠，要么需要复杂的分析流程
肝细胞癌（HCC）的早期检测仍面临挑战，目前推荐的基于超声联合甲胎蛋白（AFP）的监测策略因敏感度和可及性欠佳而受限。游离DNA（cfDNA）为癌症检测提供了一条微创途径。然而，现有大多数基于cfDNA的方法要么在低投入样本中表现不可靠，要么需要复杂的分析流程。在本研究中，研究人员系统分析了HCC患者与非HCC个体血清cfDNA的谱图，并在FAM230F基因组区域鉴定出一个高丰度的肿瘤相关单一cfDNA片段。对肝脏转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）数据的整合分析显示，该位点存在一致的肿瘤特异性染色质可及性，提示其具有肿瘤来源。结构表征进一步证明，靶序列内富集G-四链体（G4）特征，这可能增强其对血清核酸酶降解的抵抗力，并促进其在循环中的优先保留。基于这些特性，研究人员建立了一种具有临床可及性的基于定量PCR（qPCR）的检测流程。在与发现队列相互独立的验证队列中，通过最大化同一队列内的约登指数选取ΔCt截断值为2。该检测区分HCC与非HCC的敏感度为94.5%，特异度为90.5%。综上，本研究鉴定出FAM230F作为一种结构稳定的肿瘤相关cfDNA片段，并建立了一种简单、可扩展的基于qPCR的HCC检测方法，为将cfDNA片段分析转化为临床生物标志物提供了实用框架。
论文解读：基于G-四链体形成的游离DNA片段FAM230F用于肝细胞癌精准诊断的研究
一、研究背景与问题
肝细胞癌（HCC）是全球第六大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第三大原因，占原发性肝癌的90%以上。由于早期HCC缺乏特异性临床症状，约50%–60%的患者确诊时已发生转移，导致总体预后不良。目前美国肝病研究学会（AASLD）推荐对高危人群采用腹部超声联合血清甲胎蛋白（AFP）进行监测，但超声对早期HCC的敏感度仅约47%，且依赖专业设备和操作者经验；AFP单独检测的敏感度约为60%，总体诊断效能有限。因此，临床亟需开发便捷、高敏感度的分子诊断策略。游离DNA（cfDNA）作为液体活检的重要 analyte，可通过检测肿瘤相关突变、甲基化异常和片段化模式等特征实现微创肿瘤检测。然而，基于突变的方法受肿瘤异质性和循环肿瘤DNA低丰度限制，甲基化方法依赖复杂亚硫酸盐转换流程且对低投入样本敏感，片段组学方法则通常需要多步预处理和二代测序，难以在常规临床实验室推广。相比之下，利用qPCR平台定量检测特定肿瘤相关cfDNA片段的丰度，可能更符合临床可及性需求。
二、研究目标与主要发现
研究人员假设血清中存在肿瘤特异性富集的cfDNA片段，并可通过qPCR进行简便检测。基于这一假设，研究人员首先在发现队列（23例HCC患者和33例健康对照）中对血清cfDNA进行全基因组测序和差异片段分析，鉴定出位于FAM230F基因组区域的高丰度肿瘤相关cfDNA片段（FC=4.87，P<0.001）。通过整合肝脏ATAC-seq数据，研究人员证实该片段来源于肝癌细胞中肿瘤特异性开放的染色质区域。进一步的结构分析显示，该片段序列含有G-四链体（G4）形成基序，G4结构可能增强其对血清核酸酶降解的抵抗力，从而促进其在HCC患者循环中的优先富集。基于此，研究人员建立了以qPCR为核心的血清检测流程。在独立验证队列（55例HCC患者和63例非HCC参与者，其中47例健康对照、16例非恶性肝病患者）中，以ΔCt=2为截断值时，该检测区分HCC与非HCC的敏感度为94.5%，特异度为90.5%，AUC达0.971，优于AFP（敏感度77.6%）。该研究发表于《Chemical Science》。
三、关键技术方法
研究人员使用的主要技术方法包括：血清cfDNA提取与全基因组测序（发现队列）；利用SEACR进行cfDNA富集区域鉴定；对临床肝组织样本（HCC组织3例，正常肝组织2例）进行ATAC-seq以分析染色质可及性；使用QGRS Mapper预测G4形成序列；圆二色谱（CD）光谱分析G4结构形成及热稳定性；人血清和DNase I降解实验评估片段稳定性；以及基于SYBR Green的qPCR检测流程，采用外源spike-in对照计算ΔCt值。所有临床样本均来自中国科学技术大学附属第一医院，研究获伦理批准。
四、研究结果
（一）HCC相关cfDNA片段的鉴定
研究人员对发现队列cfDNA测序数据进行全基因组差异分析，以FDR<0.05和FC>1筛选差异片段。热图显示HCC与对照样本在Z-score归一化后呈现清晰分离的聚类模式。基因组注释发现，差异cfDNA峰显著富集于远端基因间区，而启动子和近端转录相关区域比例相应降低，提示肿瘤相关cfDNA片段优先来源于远端调控区域。综合FC和绝对信号强度，FAM230E（IS=135.98，FC=9.10）和FAM230F（IS=69.00，FC=4.87）片段被选为优先候选靶标，两者的cfDNA信号在HCC与对照间显著分离。
（二）HCC相关cfDNA片段的染色质起源
为探究候选片段的染色质来源，研究人员对HCC和正常肝组织进行ATAC-seq分析。结果显示，FAM230E和FAM230F区域在HCC组织中呈现更高的染色质可及性，其中FAM230F位点的ATAC-seq信号在肿瘤组织中为正常肝组织的5.85倍（Welch's t检验，P=0.0210），且与血清cfDNA富集信号一致。该结果表明，循环中FAM230E/F片段的富集可能源于肿瘤相关开放染色质区域的选择性断裂。
（三）G-四链体介导HCC相关cfDNA片段在血清中的维持
全基因组分析显示，HCC富集cfDNA片段与已报道G4基序的重叠程度显著高于随机基因组区域（P=0.000999）。QGRS Mapper预测和CD光谱证实，FAM230E和FAM230F序列均可形成G4结构，其中FAM230F呈平行型G4拓扑。K+滴定实验显示，随K+浓度升高，FAM230F在265 nm处正峰增强，提示K+促进平行型G4构象转变；FAM230F的表观解链温度（Tm）约为51 °C。血清和DNase I降解实验表明，含有完整G4基序的片段较G4破坏突变体具有更强的抗降解能力，为G4介导的结构稳定化提供了直接证据。
（四）靶向FAM230F cfDNA片段的qPCR诊断检测
研究人员针对FAM230F区域设计qPCR扩增体系，扩增子限定在124 bp检测窗口内的60 bp核心区域。在验证队列中，HCC组的ΔCt值显著低于健康对照组和非恶性肝病组（校正P<0.0001）。ROC分析显示AUC为0.971，以ΔCt=2为截断值时，敏感度94.5%，特异度90.5%；亚组分析中，健康对照组特异度91.5%，非恶性肝病组特异度87.5%。在49例具有AFP检测数据的HCC患者中，FAM230F标记的敏感度为95.9%，高于AFP的77.6%，表明其在AFP阴性病例中仍具稳健检测能力。
五、讨论与结论
讨论部分指出，既往HCC液体活检策略包括基于cfDNA的突变、甲基化、片段组学特征，以及血清蛋白标志物（如AFP-L3、DCP）、循环RNA、外泌体、代谢物和自身抗体等，但在诊断效能和分析复杂度方面差异较大。本研究提出的单片段cfDNA检测策略以肿瘤相关cfDNA片段为定量靶标，借助qPCR平台降低了分析复杂度，简化了流程，并适用于低投入血清样本。FAM230E/F属于FAM230长链非编码RNA基因家族，其区域被注释为远端基因间区，与观察到的染色质富集模式一致。已有研究表明FAM230F表达与癌症相关蛋白USP41相关，且与多种肿瘤的不良预后有关，FAM230家族其他成员也参与肿瘤发生发展，为靶标选择提供了生物学支持。结论部分翻译如下：HCC监测在临床实践中仍具挑战性，目前基于超声和AFP的策略敏感度有限，且受操作者经验和临床状况影响，导致诊断延迟，需要更敏感、可靠和可及的方法。本研究通过靶向肿瘤相关cfDNA片段，建立了一种简单、可扩展的基于qPCR的HCC诊断方法。研究人员鉴定出定位于FAM230F基因组区域的片段在HCC患者中优先富集，机制上其富集与肿瘤特异性染色质可及性和可能由G4形成序列介导的结构稳定性增强相关。该方法表现出可靠的检出能力，AUC达0.97，敏感度94.5%，特异度90.5%，优于AFP检测（77.6%）。这些发现支持一种实用且可临床转化的HCC检测策略。此外，研究人员也指出，ΔCt截断值在同一队列中选取可能使诊断性能存在优化估计，未来需在独立前瞻队列中验证；跨实验室和平台的可转移性需要标准化参考物质和多中心验证；FAM230F在肿瘤发生发展中的分子机制及其与核小体稳定性的关系仍需进一步研究。总之，该研究为将cfDNA片段生物标志物转化为临床分子检测提供了可行框架。
