层析扫描成像中单颗粒分析的采样不匹配及校正

《Ultramicroscopy》：Sampling Mismatch and Correction for Ptychographic Single-Particle Analysis

　　

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  识别并表征了扫描步长与会聚束电子衍射图像像素尺寸之间的采样不匹配现象。
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  采样不匹配会导致叠层成像重建显微图像中出现相位反转。
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  采样不匹配限制了叠层成像单颗粒分析中可达到的分辨率。
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  假设了一个虚拟光学系统，用于建模在采样不匹配存在时的信息传递过程。

引言

叠层成像近年来作为一种突出技术崭露头角，能够实现亚埃级分辨率[1]，即使在未校正的电子显微镜中也能实现[2]，从而展现出克服常规方法（如相位衬度成像和扫描透射电子显微镜（STEM））分辨率限制的重大潜力。在此背景下，叠层成像与冷冻电子显微镜（cryoEM）的结合引起了越来越多的关注[[3], [4], [5]]。然而，对冷冻水合生物样本进行低剂量和大面积成像的要求，对叠层成像中的相位恢复提出了挑战。因此，尽管叠层成像已应用于单颗粒分析（SPA），通常称为叠层成像SPA，但其应用仍停留在亚纳米分辨率水平，这显著低于传统相位衬度成像所达到的水平[6,7]。因此，阐明限制叠层成像SPA的因素已成为当务之急。

在叠层成像SPA工作流程中，冷冻水合生物样本的显微图像是通过迭代相位恢复算法[[8], [9], [10], [11]]，由一系列排列成STEM阵列的会聚束电子衍射（CBED）图像生成的。这些算法需要准确描述光学系统的参数，其中准确的扫描位置尤为关键。虽然扫描位置误差在理论上可以通过优化算法进行校正[[12], [13], [14], [15]]，但这些算法的性能通常受到高维参数空间内收敛于局部最优解的限制。先前的研究报告了叠层成像重建过程中探针位置与离焦之间的耦合，当位置优化失败时，这可能导致扫描晶格畸变和图像特征去定域[16,17]。这些观察进一步凸显了准确扫描位置和稳健位置校正策略的重要性。特别是，扫描步长的准确性经常证明是必不可少的。为应对这一挑战，Ning等人开发了一种约束梯度下降协议，将位置误差分为全局误差和局部误差，并通过分层方法进行处理[18,19]。然而，在生物标本低剂量成像中遇到的低信噪比生物成像应用中，这些方法通常表现出次优性能。此外，生物样本的叠层成像通常需要微米级视场和纳米级扫描步长。在这种尺度下，同时提供原子分辨率特征和足够大视场的校准标本，同时又适用于常规冷冻电子显微镜配置，是很少见的。因此，在实际操作中，准确的步长校准仍然是一个挑战。

在这里，我们将扫描步长的不准确性建模为与CBED图像倒易空间像素尺寸的不匹配，称为采样不匹配。我们系统地分析了其对重建显微图像尺度、重建中使用的离焦值以及叠层成像SPA中信息传递的影响。基于这些分析，我们提出了一种适用于叠层成像SPA的扫描步长校准策略。使用未配备像差校正器的冷冻电子显微镜采集的嗜热嗜酸脂肪芽孢杆菌20S蛋白酶体数据集，以及使用像差校正电子显微镜获得的已发表的去铁蛋白数据集[7]，演示了采样不匹配的影响。需要注意的是，本研究采用的显微图像代表了弱相位物体近似下叠层成像重建得出的透射函数的虚部。

章节摘要

叠层成像中的采样不匹配

扫描步长（${\delta }_{\mathrm{s}}$）和倒易空间像素尺寸（${\delta }_{\mathrm{f}}$）是叠层成像系统中指示采样频率的两个基本采样参数。它们通常分开校准并具有独立的偏差，这在叠层成像计算中是有问题的。为了展示这些偏差的影响，我们在进行进一步分析之前，首先考察了几个明显的影响。

我们考虑一个具有$N\times N$像素探测器的典型叠层成像系统，其

讨论

在本研究中，我们识别并研究了采样不匹配对叠层成像的影响，特别是其对叠层成像SPA的影响。采样不匹配主要源于每个扫描位置重建的图像块像素尺寸与扫描步长之间的不匹配。这种不匹配阻止了图像块在重叠区域内一致对齐。由于叠层成像算法固有的自适应性，这种不匹配问题并不

从实验透射函数估计调制函数

为了验证受采样不匹配影响计算出的透射函数$\stackrel{?}{\psi }$与未受影响的$\psi$之间观察到的差异源于MIMF，我们从实验透射函数中提取了这种差异，并将其表示为称为$H$的函数。$H$被假设是傅里叶空间中的一个复调制函数，定义为$F_{\stackrel{?}{\psi }}=H{F}_{\psi }+N$，其中$N$表示加性噪声。我们假设$H$关于角度是各向同性的。在每个傅里叶环内建立了一个最小二乘问题，其

作者贡献

X.L.和Y.S.启动了该项目。T.L.和X.L.对采样不匹配进行了系统研究。Z.Y.制备了T20S蛋白酶体样品。S.L.设计了数据采集策略。S.L.、T.L.和Z.Y.共同完成了T20S蛋白酶体数据集的数据采集。T.L.设计了数据处理工作流程，实现了程序并完成了所有叠层成像重建。X.L.和T.L.进行了单颗粒分析。X.L.和T.L.撰写了手稿。

数据可用性

本研究中使用和评估的数据集包括去铁蛋白的叠层成像数据集（EMPIAR-12236）、去铁蛋白的重建图（EMD-19425）、去铁蛋白（PDB:8RQB）和T20S蛋白酶体（PDB:1PMA）的原子模型。使用未校正冷冻电子显微镜采集的T20S蛋白酶体数据集可在EMPIAR-13137获取，使用校正和未校正采样参数获得的图可在EMD-67291和EMD-67292获取。

代码可用性

用于叠层成像重建的定制MATLAB流水线可在https://github.com/li-ty22/ptycho-workstation获取。此处使用的数据处理脚本可在https://github.com/li-ty22/Sampling-Mismatch-and-Correction-for-Ptychographic-Single-Particle-Analysis获取。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

未引用参考文献

[34]

CRediT作者贡献声明

李天元：写作 – 审阅与编辑、写作 – 初稿、验证、软件、方法学、概念化。李首清：数据整理。严兆义：数据整理。沈源：概念化。李学明：写作 – 审阅与编辑、写作 – 初稿、验证、监督、项目管理、方法学、资金获取、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能会影响本论文中报告的工作。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（XL: 32430056）、国家重点研发计划（XL: 2024YFA1307302）、清华-北大联合生命科学研究中心、北京生物结构前沿研究中心、深圳医学科学院（SMART）的资金支持。感谢清华大学张子颖在样品制备和单颗粒分析方面的指导；感谢马金莹和马巧阳

李天元|李首清|严兆义|沈源|李学明