《Talanta》：A signal-locked clamped hybridization chain reaction nanoamplifier for rapid and highly sensitive analysis of Aβ42
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摘要淀粉样蛋白β42（Aβ42）是与阿尔茨海默病（AD）相关的核心生物标志物，但由于基质干扰、检测灵敏度有限以及常规方法耗时长，低丰度血浆Aβ42的准确定量仍然具有挑战性。本研究开发了一种免酶荧光生物传感平台，将三螺旋适配体探针（THAP）与夹合杂交链式反应（cHCR）相结合
摘要
淀粉样蛋白β42（Aβ42）是与阿尔茨海默病（AD）相关的核心生物标志物，但由于基质干扰、检测灵敏度有限以及常规方法耗时长，低丰度血浆Aβ42的准确定量仍然具有挑战性。本研究开发了一种免酶荧光生物传感平台，将三螺旋适配体探针（THAP）与夹合杂交链式反应（cHCR）相结合，称为T-cHCR，用于高灵敏度Aβ42分析。在该系统中，Aβ42识别诱导触发探针从三螺旋锁定的THAP模块中受控释放，随后启动双发卡cHCR级联反应，实现低背景信号放大。在优化条件下，T-cHCR检测对1至1000 pg/mL的Aβ42呈线性响应，检测限为1.16 pg/mL，比本研究中使用的ELISA试剂盒制造商报告的最低可检测剂量低8.1倍。该检测还表现出可接受的特异性、重复性和储存稳定性。临床血浆样本的初步分析表明，AD患者与年龄匹配的健康对照组之间的Aβ42水平存在显著差异，支持T-cHCR在血浆AD生物标志物分析中进一步验证的潜力。总体而言，这种整合的THAP-cHCR策略为超灵敏血浆Aβ42检测提供了一种快速、免酶、低背景的方法。
引言
阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，代表老龄化人群中的主要公共卫生负担[1,2]。Aβ失调是AD的核心病理特征之一，Aβ相关生物标志物的变化可能发生在明显认知障碍之前[3-5]。尽管脑脊液（CSF）生物标志物和淀粉样蛋白正电子发射断层扫描（PET）在临床上具有信息价值，但其侵入性、高成本或有限的可及性限制了它们在大规模筛查和纵向监测中的适用性[6-8]。在此背景下，基于血液的生物标志物受到了越来越多的关注，因为外周血采集具有微创性、可重复性，并且更适用于早期AD风险评估[9]。其中，血浆Aβ42和血浆Aβ42/Aβ40比值据报道可反映脑部淀粉样蛋白病理，并有助于早期识别AD高危个体[10]。
大量努力已投入到基于免疫分析方法的血液Aβ检测中[11]。酶联免疫吸附试验（ELISA）仍然是最广泛使用的方法之一，因其操作熟悉、基于抗体的特异性以及与常规实验室工作流程的兼容性[12]。近期与ELISA相关的、基于纳米酶的以及源自免疫分析的平台已实现了血液中Aβ物种的检测，包括Aβ42、Aβ40和Aβ寡聚体，并推动了基于血液的AD生物标志物分析的发展[13-15]。然而，血浆Aβ42丰度低，易受丰裕血浆蛋白的干扰[16,17]。传统ELISA程序通常涉及多次孵育和洗涤步骤、相对较长的检测时间以及有限的信号放大效率[18]。因此，仍然需要能够在复杂血浆基质中稳健运行的快速灵敏分析策略。
为了提高蛋白质生物标志物检测的灵敏度，分子识别事件越来越多地与核酸信号放大相结合[19]。在此类设计中，抗体或适配体提供目标识别，而偶联或释放的核酸链作为可编程信号转换器启动下游放大反应[20,21]。基于DNA-抗体偶联物的检测、免疫PCR、免疫CRISPR及相关平台已证明对低丰度AD生物标志物（包括Aβ和磷酸化tau）具有强大的信号放大能力[14,15,22]。这些研究表明，将蛋白质识别转化为核酸放大是提高分析灵敏度的有效途径。然而，核酸触发物的非特异性释放和背景泄漏仍然是重要挑战，尤其是在检测血浆中的微量生物标志物时[23]。
三螺旋适配体探针（THAPs）提供了高保真目标至DNA信号转换的有吸引力策略[24,25]。在THAP中，触发链同时被Watson-Crick和Hoogsteen相互作用锁定，从而抑制在缺乏靶标时的自发触发泄漏[26]。在目标识别后，适配体发生构象重排并释放触发链以启动下游放大[27]。同时，杂交链式反应（HCR）是一种广泛使用的免酶等温扩增方法[28]。与常规线性HCR相比，夹合HCR（cHCR）可以通过稳定亚稳发卡探针和减少非特异性发卡打开来提高反应可控性[29,30]。在此，我们开发了一种整合的THAP-cHCR荧光生物传感平台，称为T-cHCR，用于快速灵敏的血浆Aβ42检测。本工作的核心创新在于将三螺旋锁定的目标识别与双发卡夹合核酸放大相结合，而不是简单地将适配体与HCR结合。
章节片段
材料与试剂
本实验中使用的所有DNA寡核苷酸序列（详细序列见附表S1）均由上海生工生物工程有限公司购得，并经高效液相色谱（HPLC）纯化。淀粉样蛋白β42（Aβ42）多肽购自上海激智生物科技有限公司，纯度≥98%（经HPLC纯化）。将其溶解于六氟异丙醇（HFIP，Sigma-Aldrich，美国）中制备1 mg mL?1储液；分装后
T-cHCR策略原理
T-cHCR策略用于Aβ42检测的工作原理如图1所示。该策略仅依赖于三个核心组分：一个THAP和两个亚稳发卡探针（H1和H2）。具体而言，THAP通过将含有Aβ42特异性适配体结构的探针APT与TP杂交构建而成。在缓慢退火过程中，APT和TP首先通过Watson-Crick碱基配对形成标准双链复合物。在最佳pH条件下，APT的3'端进一步相互作用的
结论
总之，本研究提出了一种基于T-cHCR的荧光生物传感平台，用于快速灵敏地定量血浆Aβ42。所提出的系统在单次检测中整合了两个互补的功能单元：THAP模块实现靶标响应式触发释放并降低背景泄漏，而cHCR模块提供快速免酶信号放大。在优化条件下，T-cHCR检测实现了低检测限1.16 pg/mL和定量限1.57 pg/mL，
CRediT作者贡献声明
孔相吉：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 初稿，可视化，软件，资源，方法论，调查，正式分析，数据管理，概念化。姜浩然：撰写 – 初稿，可视化，验证，资源，方法论，数据管理。胡彪：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 初稿，可视化，验证，资源，调查，数据管理。舒秋霞：撰写 – 初稿，验证，软件，方法论，
利益冲突声明
作者声明他们不存在已知的可能影响本文所报告工作的竞争经济利益或个人关系。
致谢
本工作得到中国西藏自治区自然科学基金（XZ202501ZR0081）、中国重庆市自然科学基金（CSTB2024NSCQ-KJFZMSX0079）以及陆军军医大学研究生科研创新项目（YJSCX2024S04）的支持。
孔相吉|姜浩然|胡彪|舒秋霞|罗新威|潘峰|胡军|王哲
陆军军医大学（第三军医大学）西南医院神经内科，中国重庆，400038
