基于内在过滤效应的有机小分子荧光探针，用于维生素B12检测和细胞成像

《Tetrahedron》：An Inner Filter Effect-Based Organic Small-Molecule Fluorescent Probe for Vitamin B12 Sensing and Cell Imaging

　　

摘要

维生素B12（VB12）的准确量化对人类健康至关重要。为了解决传统纳米传感器所具有的生物毒性问题，我们开发了PyFR，这是一种基于有机小分子的新型荧光探针，用于VB12的检测，并利用了“内滤效应”（IFE）。PyFR具有100纳米的显著斯托克斯位移（Stokes shift），这有助于减少自吸收，并表现出出色的选择性。它在0-40微摩尔（μM）范围内呈现出线性响应，最低检测限为37.5纳摩尔（nM）。在实际应用中，PyFR能够有效量化商业药品中的VB12，回收率在98.1%到102.4%之间，并且由于其低细胞毒性，便于监测活细胞中对VB12的吸收情况。因此，PyFR为药品质量控制和生物医学研究提供了一个准确且生物相容的光学平台。

引言

维生素B12（VB12），也称为钴胺素，是一种含有钴的晶体复合物，通常形成独特的红色针状晶体^1。它参与多种代谢过程，对人类和动物的健康都至关重要。具体而言，VB12对于维持健康的神经细胞和红细胞以及DNA复制起着关键作用。VB12缺乏是巨幼红细胞性贫血的主要原因[2],[3]。此外，VB12与维生素B6和叶酸一起，有助于降低同型半胱氨酸的水平，而同型半胱氨酸是动脉粥样硬化发病机制中的一个已知风险因素[4],[5]。由于其重要的生理意义，准确量化VB12的浓度至关重要。VB12水平不足可能导致贫血、心血管疾病和神经系统损伤，而过量摄入则可能引发包括肝功能障碍和肾衰竭在内的不良后果[6],[7]。

自1948年首次分离出VB12以来，在复杂的天然基质中对其进行分析测定一直是一个巨大的挑战。迄今为止，已经采用了多种分析技术来量化VB12，如高效液相色谱（HPLC）[8],[9]、电化学方法[10],[11]以及基于荧光的检测方法[12],[13]。其中，基于荧光的检测方法因其快速性、简单性、成本效益和合理的灵敏度而受到青睐[14],[15],[16],[17],[18]。量子点（QDs）和碳量子点（CQDs）等荧光纳米传感器已被成功应用于VB12的检测[19],[20],[21],[22],[23],[24],[25],[26],[27]。然而，解决这些荧光探针的生物毒性问题并确保其生物安全性仍然是一个紧迫的任务。与纳米传感器不同，有机小分子荧光探针提供了一个没有相关限制的替代方案；然而，目前记录在案的用于VB12检测的此类探针数量仍然有限。例如，MPDPI和HINBD探针通过动态淬灭机制展示了在药物制剂中对VB12的选择性和敏感性[28],[29]。需要注意的是，由于VB12的正常生理浓度范围较窄（<200-900 pg/mL，人体血清中约为147.6 pM至664 pM）^30，这些探针在实现超低浓度样本的绝对定量准确性方面存在局限，而且关于用于研究细胞内VB12的相关探针的报道也非常少。因此，迫切需要开发专门针对VB12分析的有机小分子荧光探针。

在本文中，我们报道了一种有机小分子荧光探针PyFR的设计、合成和应用。该探针具有强烈的内在荧光性。当添加VB12时，会引发PyFR荧光发射的显著淬灭现象。这种“关闭”响应主要归因于“内滤效应”（IFE），这是由于VB12的紫外-可见光（UV-Vis）吸收光谱与PyFR的激发/发射光谱之间的显著光谱重叠造成的。值得注意的是，PyFR具有极低的检测限（LOD = 37.5 nM）和100纳米的较大斯托克斯位移。通过其在药品配方中准确量化VB12以及实时动态监测活细胞中VB12吸收的能力，证明了PyFR

章节片段

实验部分

中间体2的合成：化合物1（4-(异丙基氨基)-3-硝基苯甲醛）是根据先前发表的步骤合成的^31。然后，将化合物1（458毫克，2.2毫米摩尔），1,4-二甲基吡啶-1-鎓碘化物（470毫克，2.0毫米摩尔）和无水乙醇（15毫升）依次加入50毫升的圆底烧瓶中。混合物在氮气环境中纯化30分钟以去除溶解的氧气，随后在90°C下搅拌24小时。冷却至室温后，

结果与讨论

PyFR探针基于“内滤效应”（IFE）机制设计，作为一种荧光“关闭”探针，能够高度选择性和灵敏地检测VB12。其核心设计原理在于VB12的紫外-可见光（UV-Vis）吸收光谱与PyFR的激发/发射光谱之间的光谱重叠。当这两种物质同时存在于溶液中时，VB12会有效吸收PyFR发射的荧光，导致荧光强度显著下降。

结论

在本研究中，我们开发了一种新型荧光探针PyFR，用于灵敏且选择性地检测VB12。PyFR通过“内滤效应”（IFE）机制表现出荧光“关闭”响应，这是由于VB12的UV-Vis吸收光谱与PyFR的激发/发射光谱之间的显著重叠所致。PyFR对VB12表现出强烈的线性响应，实现了极低的检测限（LOD）37.5 nM。在实际应用中，

CRediT作者贡献声明

王志明：撰写——原始草稿、可视化、验证、实验、数据分析、数据整理。 蔡松涛：撰写——审阅与编辑、原始草稿的修改、监督、数据整理。 刘畅：撰写——审阅与编辑、监督、资源获取、概念构思。 曾贤顺：监督、资金获取、概念构思。

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。

我们衷心感谢国家自然科学基金（NNSFC，项目编号21907075）和天津市自然科学基金（项目编号23JCZDJC00320、18JCQNJC75900）的支持。

王志明 | 蔡松涛 | 刘畅 | 曾贤顺 山东潍坊大学化学与化学工程及环境工程学院，中国潍坊，261061