与血浆相比，基于细胞外囊泡的FTIR光谱技术能够更灵敏地检测结直肠癌

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Extracellular vesicle–derived FTIR spectroscopy enables sensitive detection of colorectal cancer compared to plasma

　　

摘要

本文采用傅里叶变换红外（FTIR）光谱技术与多元分析相结合的方法，研究了结肠直肠癌（CRC）患者与健康对照组所产生的血浆和细胞外囊泡（EVs）之间的生化差异，并评估了其诊断潜力。血浆和EVs的光谱都显示出生物材料的特征性FTIR谱带，包括碳水化合物和磷酸基团的振动（900–1200 cm^?1）、与蛋白质相关的酰胺I和II带（约1650和1540–1560 cm^?1）、与脂质相关的CH伸缩模式（2800–3000 cm^?1），以及宽的O–H/N–H伸缩带（3200–3400 cm^?1）。虽然癌症患者和健康对照组血浆的光谱有显著重叠，但仅有细微的差异；而EVs的光谱显示出了更明显的变化，尤其是在与蛋白质和脂质相关的区域。无监督分析证实了这些观察结果。在800–1800 cm^?1范围内进行的分层聚类分析发现，血浆样本之间的区分度有限，反映了血浆的生化异质性。相比之下，EVs的光谱根据疾病状态表现出更清晰的聚类。主成分分析和均匀流形近似投影进一步证明了EVs样本之间更强的、更一致的分离效果，而血浆样本则基本混杂在一起。使用Boruta和蒙特卡洛特征选择方法，在“留一法”（LOPO）框架下评估了特征选择的稳定性。区分CRC患者血浆与健康对照血浆的稳定特征数量较少，表明疾病相关变化较为微妙。相比之下，CRC患者EVs与健康对照组EVs的比较显示出了与蛋白质、脂质和磷酸基团相关的非常稳定的特征。在LOPO交叉验证下，使用LDA、PLS-DA、随机森林和支持向量机等方法进行监督分类，结果显示CRC患者血浆与健康对照血浆的准确率在60.4–68.8%之间，而CRC患者EVs与健康对照组EVs的准确率则始终保持在95.6–97.8%之间。

研究结果表明，EVs来源的FTIR光谱提供了比血浆更稳健、更具诊断信息的CRC特征，这表明EVs是用于无创癌症检测的有希望的来源。

引言

结肠直肠癌（CRC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，也是导致癌症相关死亡的主要原因[1]。尽管治疗方法有所进步，但患者的预后仍很大程度上取决于诊断时的疾病阶段，这凸显出需要灵敏且微创的方法来检测与肿瘤发展相关的早期生化变化[2]。因此，基于液液活检的方法作为癌症检测和治疗监测的工具受到了越来越多的关注[3],[4],[5]。

细胞外囊泡（EVs）是由细胞释放到细胞外空间和体液（包括血浆）中的异质性膜包裹粒子[6]。它们包含多种亚群体，具有不同的大小和生成方式[7]，并携带来自其来源细胞的丰富分子 cargo，包括蛋白质、脂质、核酸和代谢物[8]。在癌症背景下，EVs不仅仅是细胞活动的被动副产品，还在细胞间通信和肿瘤进展中起着积极作用。肿瘤来源的EVs（TEVs）已被证明可以促进癌细胞之间的信号传递、调节肿瘤微环境、促进免疫逃逸、血管生成和转移性微环境的形成，并支持癌症在远处的扩散[9],[10]。重要的是，TEVs的分子组成反映了亲本癌细胞的遗传和表型变化，使它们成为携带疾病特异性生化特征的高度有信息的载体。由于EVs的膜能保护其 cargo免受酶降解，因此TEVs相关的分子信息在循环系统中相对稳定，进一步增强了它们作为基于液液活检的癌症检测（bio）标记物的潜力。血浆是临床诊断和生物医学研究中最常用的液液活检材料，因为它易于获取且所需的侵入性最小[11]。然而，血浆是一种极为复杂和动态的生物流体，含有来自多种器官和生理过程的丰富蛋白质、脂蛋白、代谢物和信号分子。因此，与癌症相关的分子变化可能会在高度复杂的血浆基质中被稀释，或者被个体间差异、炎症、代谢状态或其他非恶性条件所掩盖。与整个血浆不同，分离出的EVs代表了来自其来源细胞的独特分子信息。在癌症中，肿瘤细胞会持续向循环系统中释放EVs，且随着肿瘤负担和疾病进展，TEVs的数量可能会增加[12],[13],[14]。然而，癌症患者体内的循环EVs是一个异质群体，不仅来自肿瘤细胞，还来自免疫细胞、内皮细胞和其他非恶性细胞。因此，富含EVs的部分不能被认为是肿瘤特异性的，除非直接确定其细胞来源，否则不能假设TEVs的贡献增加。尽管如此，循环EVs的 compartmentalized 分子 cargo 可能反映了与肿瘤相关的过程以及宿主对疾病的系统反应。综上所述，这些观察结果为评估富含EVs的部分是否比整个血浆具有更好的诊断性能提供了依据。近年来，振动光谱学已成为基于细胞外囊泡（EV）的癌症诊断的一种有前景的方法。傅里叶变换红外（FTIR）光谱和拉曼光谱都提供了无标记的分子指纹，反映了EVs的总体生化组成，包括蛋白质、脂质、核酸和碳水化合物。多项近期研究表明，使用EVs进行拉曼光谱检测癌症是可行的，这些研究显示了令人鼓舞的诊断性能，并强调了拉曼光谱捕捉疾病相关生化变化的能力[15],[16],[17],[18]。同样，红外光谱学的最新进展也证实了基于FTIR的方法在EV特征表征和疾病分类方面的潜力[19],[20],[21],[22],[23]。然而，尽管有这些积极的发展，但目前尚未系统地比较过同一组CRC患者血浆与EVs来源的FTIR光谱的诊断性能。在这种情况下，能够捕捉全局生化特征同时对血浆和EV组成中的细微分子变化敏感的分析技术非常受欢迎。FTIR光谱通过提供基于蛋白质、脂质、碳水化合物和核酸的振动特征的快速、无标记、非破坏性的分子指纹满足了这些要求[24]。当与多元统计分析和机器学习方法结合使用时，FTIR能够在无需预先知道特定生物标志物的情况下区分不同疾病状态[25],[26]。重要的是，将FTIR光谱应用于富含EVs的部分可以通过减少整个血浆的复杂性并丰富肿瘤来源的分子信息来提高癌症相关生化变化的检测效果。这为直接比较血浆和EVs来源的FTIR光谱以评估它们在CRC中的相对诊断性能提供了有力的依据。因此，本研究的新颖之处不仅在于将FTIR光谱应用于EVs来源的样本，更重要的是在相同的个体上使用相同的预处理、多元统计分析、特征选择方法和机器学习工作流程，系统地对血浆和EVs的FTIR光谱进行了头对头的比较。本研究旨在确定EV分离是否比整个血浆提供了额外的诊断价值，以及EVs来源的光谱是否包含更稳健和生物学上更有意义的结肠直肠癌特征。这种直接比较在以前的研究中尚未得到全面探讨，对于建立基于EV的FTIR液液活检的临床实用性至关重要。

章节片段

患者和样本收集

本研究共纳入了48份样本，这些样本来自波兰克拉科夫雅盖隆大学医学院第二普通外科部门诊断出的CRC患者，代表了不同疾病阶段的患者，在接受任何肿瘤学治疗之前收集的样本。研究组中的程序包括为治疗癌症而进行的结肠直肠切除术。已接受新辅助化疗的患者被排除在外。所有手术均采用腹腔镜技术进行

结果

在血浆和EV光谱中，都可以清晰地看到几个典型的生物样品FTIR谱带，如图1所示。900至1200 cm^?1区域主要由来自核酸和磷脂的碳水化合物和磷酸二酯基团（PO₂^?）的振动所主导[35],[36],[37],[38]。大约1400–1460 cm^?1处观察到的谱带对应于蛋白质和脂质的CH₃弯曲振动[39],[40]。酰胺II带（约1540–1560 cm^?1）和酰胺I带（约1650 cm^?1

讨论

本研究表明，FTIR光谱结合多元分析和机器学习方法能够捕捉CRC患者与健康对照组之间的生物学相关差异，EVs提供的诊断信息比整个血浆更为稳健。在所有分析阶段，包括无监督聚类、特征选择和监督分类中，EVs来源的光谱在组别分离和特征稳定性方面始终优于血浆

结论

本研究表明，FTIR光谱结合稳定性感知的特征选择和LOPO-CV方法能够可靠且生物学上有意义地区分CRC患者和健康献血者的样本。EVs始终呈现出比血浆更强和更稳定的光谱特征，反映了它们 compartmentalized 分子 cargo 的差异以及CRC相关生化变化的更好检测能力。EVs来源的类别被分类为高

资助

本研究得到了波兰国家科学中心的资助，资助编号分别为2021/41/N/NZ6/02770（I.S.）和2019/03/X/NZ6/00840（M.R.）。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文报道工作的竞争性财务利益或个人关系。

Adrian Odrzywolski|Izabela Sieminska|Bartosz Klebowski|Mateusz Wierdak|Mateusz Rubinkiewicz|Jarek Baran|Joanna Depciuch

卢布林医科大学生物化学与分子生物学系，Chod?ki 1，卢布林 20-093，波兰