一种基于苯并噻唑的荧光探针用于半胱氨酸的快速光谱检测以及细胞和斑马鱼中的生物成像

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：A benzothiazole-based fluorescent probe for rapid spectroscopic detection of cysteine and bioimaging in cells and zebrafish

　　

摘要

半胱氨酸（Cys）是一种重要的低分子量生物硫醇，其异常波动与氧化还原失衡及多种疾病相关过程密切相关。在此，我们报道了一种丙烯酸酯官能化的苯并噻唑荧光探针HBT-D，用于Cys的选择性检测和生物成像。由于丙烯酸酯单元阻断了苯并噻唑荧光团的ESIPT过程，HBT-D在游离状态下荧光微弱。与Cys反应后，丙烯酸酯基团的裂解恢复了ESIPT通路，在约450 nm处产生明显的开启型发射，并伴有从无色到蓝色的可见颜色变化。在优化条件下，HBT-D在5 min内对Cys响应，并呈现浓度依赖性荧光增强，检测限为7.51 μM。该探针对Cys相较于Hcy、GSH及其他生物学相关物种表现出优先响应性。高分辨质谱（HRMS）分析支持了所提出的Cys诱导丙烯酸酯裂解机制。此外，HBT-D表现出低细胞毒性，并成功用于HeLa细胞和斑马鱼中Cys的荧光成像。这些结果表明，HBT-D提供了一种用于生物体系中Cys检测的简便荧光方法。

引言

生物硫醇在维持生命系统正常生理功能中发挥重要作用。其中，半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）[1], [2], [3] 是主要的低分子量硫醇，由于其强亲核性和还原性而参与多种生物过程。作为一种重要的含硫氨基酸，Cys参与抗氧化防御[4], [5], [6], [7]、蛋白质折叠与修饰[8], [9]以及细胞内信号转导[10]。Cys水平异常与多种疾病的发生密切相关[11], [12], [13]，包括癌症[14], [15]、心血管疾病[16], [17], [18]和神经退行性疾病[19], [20]。因此，开发Cys选择性检测的高效方法对于生物研究和疾病诊断具有重要意义。

传统的Cys分析方法，如高效液相色谱法（HPLC）[21], [22]、质谱法（MS）[23]、电化学分析和酶联免疫吸附测定（ELISA）[24]，通常具有高精度和高灵敏度。然而，这些方法往往需要复杂的样品前处理、昂贵的仪器和繁琐的操作程序，这限制了其在实时监测和细胞内成像中的应用。相比之下，荧光探针因其高灵敏度、操作简便、响应快速以及在生命系统中适用于无创检测而备受关注[25], [26], [27], [28]。近期研究进一步证明了可激活荧光探针在复杂生物系统中生物硫醇传感和生物标志物成像的广泛适用性[29], [30], [31]。基于ESIPT的荧光团常用于荧光探针设计，因为它们能提供大的斯托克斯位移和低背景信号[32], [33], [34]。特别是2-(2′-羟基苯基)苯并噻唑（HBT）衍生物因其稳定的荧光特性和良好的生物相容性而在荧光探针设计中被广泛使用。

同时，丙烯酰基被认为是一种有效的Cys识别位点，因为它能与硫醇基团发生特异性亲核加成反应，随后发生分子内环化，从而导致荧光信号恢复。与Hcy和GSH相比，Cys由于其有利的成环过程而通常表现出更快的反应动力学和更高的反应活性，这为选择性识别提供了重要依据[35]。基于这一策略，我们设计并合成了一种苯并噻唑基荧光探针HBT-D，用于Cys的快速选择性检测。该探针以丙烯酸酯基团作为Cys响应位点、HBT单元作为ESIPT荧光团构建而成。与Cys反应后，丙烯酸酯基团被去除，ESIPT过程得以恢复，导致荧光显著增强并伴随明显的颜色变化。该探针对Cys表现出良好的选择性、快速响应和低细胞毒性，并已成功应用于HeLa细胞和斑马鱼的荧光成像，展示了其在生物应用中的潜力。

章节摘要

探针设计与合成

HBT-3的合成步骤和表征数据见支持信息。除另有说明外，探针合成所用试剂均购自Aldrich公司。

化合物HBT-D的合成与表征：在冰浴和氮气氛围下，将化合物HBT-3与丙烯酰氯溶于10 mL二氯甲烷中，并加入0.2 mL三乙胺。混合物在室温下反应3 h。反应过程通过薄层色谱监测

HBT-D对Cys的紫外-可见吸收响应

在PBS/DMSO（1,1, v/v, pH = 7.4）中研究了HBT-D对Cys的吸收行为。如图1所示，HBT-D在约520 nm处表现出明显的吸收带。加入Cys后，该吸收带显著降低。同时，300–350 nm区域的吸收强度增加，使其吸收光谱与游离探针明显不同。该结果表明HBT-D与Cys发生了反应。（见图1。）

HBT-D对Cys的荧光响应

随后研究了HBT-D对Cys的荧光响应

结论

总之，开发了HBT-D作为一种丙烯酸酯官能化的苯并噻唑探针用于Cys检测和生物成像。该探针通过丙烯酸酯裂解和ESIPT恢复对Cys表现出快速的开启型荧光响应，发射峰在约450 nm处，并伴有从无色到蓝色的可见颜色变化。HBT-D在5 min内对Cys响应，且相较于Hcy、GSH及其他受测物种表现出优先选择性。HRMS分析支持了所提出的传感机制。

利益冲突声明

作者声明，不存在可能影响本文所报道工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本研究得到太原市科技局的资助。感谢匿名审稿人提出的建设性意见。

赵宏伟 | 沈雨澍 | 姬亚周

山西大学化学与化工学院，中国太原 030006