采用拉曼光谱耦合MCR-ALS算法对骨关节炎软骨下骨分级特异性分子改变的无标记分析

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Label-free analysis of grade-specific molecular alterations in osteoarthritic subchondral bone using Raman spectroscopy coupled with MCR-ALS

　　

摘要

软骨下骨代谢的变化是骨关节炎（OA）进展的核心，突显了对能够解析复杂生物组织基质中分子水平改变的敏感、无标记分析方法的迫切需求。拉曼光谱是一种强大的、非破坏性的工具，用于检测完整病理组织中的分子变化；然而，重叠的谱带会妨碍准确的解读。本研究将拉曼光谱与多元曲线分辨-交替最小二乘法（MCR-ALS）相结合，应用于不同骨关节炎退化阶段的人体软骨下骨，以识别分期特异性分子变化。MCR-ALS方法能够将有重叠的拉曼光谱分解为归属于矿物质、脂质和胶原的独立生化成分。比较统计分析揭示了骨关节炎软骨下骨中依赖于分期的生化改变。在早期阶段，矿物质或脂质含量未发生显著变化；然而，在晚期退化中观察到明显的矿物质减少和脂质积累增强。胶原含量在早期阶段最初增加，随后在晚期阶段大幅下降，并伴随其结构组织的进行性破坏。酰胺I带的反卷积进一步实现了对完整组织中胶原结构改变的更好表征。这些发现表明，拉曼-MCR方法能有效解析复杂的生物光谱，灵敏地检测骨关节炎软骨下骨中分期特异性分子改变，并为完整组织的无标记表征提供了一个稳健的分析框架。

引言

骨关节炎（OA）是一种普遍存在的疾病，也是老年人群中疼痛和残疾的主要来源[1]。它涵盖了一系列以关节软骨及相关软骨下骨的进行性退化为特征的疾病谱，最终导致关节功能障碍和疼痛[2]。特别是，膝骨关节炎是一种复杂的骨骼细胞外基质（ECM）退行性关节病，其机制在很大程度上尚不清楚，其特征是关节软骨的崩解和软骨下骨稳态的破坏。关节软骨退化一直被认为是该疾病的标志；然而，多项研究表明，软骨下骨的变化可能发生较早，并可能先于软骨损伤[3]。尽管如此，这仍存在争议且未完全理解，突显了理解OA进展过程中软骨下骨骨关节炎退化中生化变化的必要性。

软骨下骨位于透明关节软骨下方，形成一个致密的、多孔的钙化层，其中包含血管通道和神经纤维，而骨的松质骨部分则由不断进行重塑的松质结构组成。软骨下骨在提供机械支持和营养供应给软骨方面起着至关重要的作用。因此，软骨下骨中任何微环境的变化都可能直接或间接地影响软骨代谢[2]，[4]。骨本身由有机成分和无机成分组成。I型胶原约占有机基质的90%，形成微纤维并组装成稳定的胶原网络，对骨的机械完整性至关重要。无机相主要包括羟基磷灰石等矿物质。除胶原外，有机基质还含有脂质和各种非胶原蛋白，如蛋白聚糖[5]。要了解软骨下骨在OA中的作用，关键是研究OA进展过程中软骨下骨中发生的生化变化。

已知胶原组成和交联的变化也对骨质量退化和由此产生的骨折风险有显著贡献[6]。胶原交联的程度和性质可能是影响骨质量的关键因素，进而影响其强度和韧性[6]。交联比的改变对应于胶原基质二级结构的变化、脂质相关特征的位移，还与基质结晶度、碳酸盐取代和矿化的变化有关[7]。研究表明，OA软骨下骨中的蛋白质相对无序[8]。脂质存在于矿化骨组织和骨细胞中，通常结合松散且易于提取。相比之下，矿化胶原基质中的脂质复合物与蛋白质和其他矿物质结合更为紧密[7]。研究显示，骨关节炎患者的软骨下骨脂质含量高于对照组[9]。脂质作为胶原纤维矿化的成核位点，与胶原交联增加、骨韧性降低和力学性能受损相关，从而加剧骨脆弱性和OA的进展[6]。然而，在人类软骨下骨骨关节炎退化进展过程中，脂质积累变化的程度仍未被探索。此外，骨矿物质组成的变化——包括矿物质含量、羟基含量和Ca/P摩尔比的改变，以及碳酸盐取代及其变化——可能导致骨骼更僵硬和更脆弱[7]。骨的矿化度，即矿物质与基质比（MMR），随着OA的进展而降低[10]。Ren等人探索发现，基质矿化度与硫酸化糖胺聚糖（sGAG）含量的相关性比其他参数（如矿物质结晶度/成熟度和B型碳酸盐取代）更强。在所考察的谱图中，ν? PO?3?/酰胺III表现出与sGAG含量最强的相关性，优于ν? PO?3?/酰胺I或ν? PO?3?/CH?摇摆，且随着OA进展这一趋势更为明显。这些发现突显了软骨下骨矿化在OA发展和进展中的重要角色[11]。

大量证据表明，软骨下骨代谢的改变是OA退化过程中的组成部分。这些变化不仅仅是软骨损伤的继发结果，而是反映了软骨下骨对疾病进展的主动贡献。Xu等人使用micro-CT研究了膝固定后大鼠模型中软骨下骨及其上方软骨的空间和时间变化。他们的发现显示，软骨下骨的变化发生在关节软骨改变之前，表明固定诱导的骨变化至少部分导致了软骨退化[12]。同样，Wang等人研究了早期OA，发现软骨下骨的超微结构变化出现在显微软骨退化之前，表明软骨下骨可能在启动软骨损伤中发挥作用[13]。软骨下骨组织中的细胞外基质蛋白重塑发生在软骨丢失之前，进一步支持了软骨下骨变化是OA发病早期事件这一概念[3]。因此，对软骨下骨变化进行系统和准确的分析对于更好地理解骨关节炎进行性退化至关重要。靶向软骨下骨吸收和/或形成是广泛接受的治疗策略。关于调节骨重塑药物的新数据进一步支持了OA新型治疗的潜力，并突显了需要在此领域进行持续、更精确研究的必要性。拉曼光谱已成为一种强大的、非破坏性的、无标记的分析技术，用于检查骨组织在水合完整状态下的生化组成和结构组织，无需大量样品处理。

拉曼光谱检测非弹性散射激光光，产生与样品中存在分子的特征振动模式相对应的光谱。这使得该技术可作为无标记生化分析的非破坏性工具，通过产生生物样本的振动指纹来实现。大量研究突出了拉曼光谱在灵敏早期检测方面的巨大潜力，通过捕捉与组织和细胞中分子改变相关的光学信号的细微变化来实现[14]，[15]，[16]，[17]，[18]，[19]。例如，Fan等人综述了拉曼光谱区分健康组织与骨关节炎组织的能力[20]。骨关节炎软骨中的分子改变已被确定为OA的早期标志物[21]。尽管潜力巨大，但由于不同生物分子间存在大量光谱重叠，解读生物样本的拉曼光谱仍然具有挑战性，这使得分离单个成分变得困难。因此，需要先进的分析方法将复合光谱分离为其底层组分并量化其在骨关节炎退化不同阶段的相对贡献。光谱解混策略，如MCR-ALS算法，提供了一种有效的方法将有重叠的拉曼带解析为独立的生化特征并估计其相应浓度[22]，[23]。骨拉曼光谱的生化指纹区（300–1800 cm?1）可以提供关于组织矿物质和有机成分的综合见解[24]。

据我们所知，对于骨关节炎人体软骨下骨分子改变的分期结构化表征——超越简单的早期与晚期比较——仍很大程度上未被探索。通过提供详细的、无标记的分子见解，这种方法推进了对骨质量恶化的理解，并阐明了疾病进展背后的生化机制。此类研究还可能进一步促进OA中分期特异性治疗靶点的客观识别。在本研究中，通过将拉曼光谱与MCR-ALS算法相结合，研究了人体软骨下骨在三个骨关节炎临床分期中的生化改变。MCR-ALS框架能够将有重叠的软骨下骨光谱特征分解为三个主要生化成分——矿物质、脂质和胶原——从而允许评估它们在疾病进展中的相对贡献。此外，对所选拉曼光谱标记进行了统计分析，以评估矿物质与基质比、矿物质结晶度、胶原交联和有机基质其他特征的分期依赖性变化。此外，还进行了酰胺I区的反卷积，以探究人体软骨下骨在不同分期中胶原二级结构的改变。为确保解析轮廓的分析稳健性和可靠性，系统评估了不确定性、旋转模糊性和MCR残差。

组织样本和拉曼光谱采集片段

骨关节炎软骨下骨样本取自接受膝关节置换术患者的股骨髁。所有患者均确认无既往膝关节手术史。样本共来自14名患者（9名男性和5名女性），年龄均超过65岁。组织切片按照标准ICRS（国际软骨研究协会）分级系统进行分类[25]。进行性退化伴随OA ICRS分级递增（G-I、G-II和G-III）。

结果片段

图3(a–c)展示了分别对应G-I、G-II和G-III的骨关节炎人体软骨下骨的平均拉曼光谱，而图3(d–f)则展示了I期与II期之间、II期与III期之间以及I期与III期之间的光谱差异。G-I与G-III之间的光谱差异比G-I与G-II或G-II与G-III之间的差异更为显著。在430 cm?1、587 cm?1、959 cm?1、1004 cm?1、1070 cm?1、1246 cm?1处观察到显著的光谱峰。

讨论片段

软骨下骨重塑在OA的发病和进展中起着关键作用，通过破坏机械载荷分布以及改变生化信号通路来积极促进软骨退化。骨转换的进行性变化——包括不同骨关节炎分期中的矿化、有机基质和微结构变化——促进了动态的、分期依赖性的退化级联反应。因此，更准确的[分析对于理解OA进展至关重要]。

结论片段

拉曼光谱与MCR-ALS相结合为解析骨关节炎软骨下骨分子水平改变提供了一个强大的无标记平台。在本研究中，该方法实现了对有重叠光谱特征的有效反卷积，允许同时表征三个骨关节炎分期中的矿物质和有机基质成分。观察到明显的分期依赖性分子改变，其特征为矿化度降低、脂质[积累增加]。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些关系可能会影响本报告中所述工作的公正性。

致谢

我们感谢印度政府生物技术部（DBT）颁发的Ramalingaswami回归奖学金所提供的支持。

作者

Gavish Uppal | Akhilesh Singh | Ramviyas Nattanmai Parasuraman | Anup Kumar | Kailash Chandra Jena | Rajesh Kumar

印度罗帕尔印度理工学院生物医学工程系，印度旁遮普邦鲁普纳加尔，邮编140001