棕榈酰酰基转移酶Zdhhc17通过靶向核转运因子Kpna2和Ipo9促进脊髓损伤后功能恢复

《Advanced Science》：Palmitoyl Acyltransferase Zdhhc17 Promotes Functional Recovery After Spinal Cord Injury by Targeting the Nuclear Transport Factors Kpna2 and Ipo9

　　

成年哺乳动物中，脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）后的功能恢复不佳，主要归因于重建受损神经连接的能力极为有限以及神经元丢失。在此，研究人员识别了Zdhhc17作为棕榈酰酰基转移酶（palmitoyl acyltransferase, PAT）在SCI后的神经保护作用。体外和体内神经元特异性Zdhhc17过表达以依赖PAT活性的方式显著增强SCI后的轴突再生和功能恢复。在皮层神经元中进行的相互作用组和棕榈酰化分析，将核转运蛋白Kpna2和Ipo9识别为先前未被发现的Zdhhc17底物。SCI显著降低Kpna2和Ipo9的蛋白水平，而Zdhhc17介导的棕榈酰化通过抑制它们泛素依赖性降解来稳定这些蛋白。功能上，神经元过表达Kpna2或Ipo9可模拟Zdhhc17的治疗效果，且Zdhhc17与Ipo9（而非Kpna2）共表达可进一步增强SCI修复。利用H₂O₂诱导的氧化应激和谷氨酸诱导的兴奋毒性模型，研究人员进一步表明Zdhhc17促进神经元存活，并在损伤后激活内在促再生基因的转录。这些发现表明Zdhhc17-Kpna2/Ipo9轴是SCI治疗的一个新的药理学靶点。

成年哺乳动物脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）后功能恢复差，主要因为中枢神经系统（central nervous system, CNS）神经元内在再生能力有限，加上损伤破坏神经回路和神经元丢失。虽然外周神经损伤可诱导再生，但CNS恶劣微环境使机制不通用。蛋白质S-棕榈酰化是一种重要的翻译后修饰，由含DHHC基序的棕榈酰酰基转移酶（palmitoyl acyltransferase, PAT）家族催化。Zdhhc17（又称HIP14）是第一个在神经元中鉴定出的PAT，参与突触可塑性和轴突生长，但它在SCI中的角色和分子机制尚不清楚。另一方面，核转运蛋白（karyopherin）家族介导核质运输，在损伤信号传导中起关键作用，然而其棕榈酰化修饰是否参与神经损伤修复从未被探索。因此，研究人员针对Zdhhc17在SCI修复中的作用及底物开展研究，成果发表于《Advanced Science》。

研究人员首先在大鼠SCI模型中利用AAV-hSyn1神经元特异性表达系统过表达Zdhhc17，发现能显著改善后肢运动功能、神经电生理和组织学指标，并且这种作用依赖PAT活性。随后通过免疫沉淀-质谱（IP-MS）和酰基-树脂辅助捕获（Acyl-RAC）实验，鉴定出核转运蛋白Kpna2和Ipo9为Zdhhc17的新底物。SCI会降低Kpna2/Ipo9蛋白水平，而Zdhhc17棕榈酰化可通过抑制泛素-蛋白酶体降解稳定它们。体内外功能实验表明，过表达Kpna2或Ipo9可模拟Zdhhc17的修复效果，其中Ipo9与Zdhhc17协同增强修复。在H₂O₂氧化应激和谷氨酸兴奋毒性模型中，Zdhhc17还能减少神经元死亡并激活促再生基因转录。这些结果确立了Zdhhc17-Kpna2/Ipo9轴作为SCI治疗的潜在药理学靶点。

关键技术方法包括：采用成年雌性SD大鼠T9-T11压迫性SCI模型；AAV-hSyn1介导的神经元特异性基因过表达；原代皮层神经元（来自E18-19 SD大鼠胚胎）划痕损伤模型；IP-MS鉴定蛋白质相互作用组；Acyl-RAC检测棕榈酰化；环己酰亚胺（CHX）追踪和泛素化实验评估蛋白稳定性；通过BBB评分、平衡木、Rivlin、游泳等行为学测试以及运动诱发电位（MEP）和BDA顺行示踪评估功能恢复；利用H₂O₂和谷氨酸处理模拟损伤，结合LDH释放和qPCR分析。

结果部分详细如下：

3.1 神经元特异性恢复Zdhhc17促进SCI后功能恢复：研究人员使用AAV-Zdhhc17-Flag在成年大鼠脊髓神经元过表达，发现损伤导致的Zdhhc17和MAP2下降被恢复；大鼠后肢能以足底负重行走；BBB评分、平衡木和Rivlin测试改善；MEP振幅增加、潜伏期缩短；病灶区5-HT、βIII-tubulin和MAP2免疫荧光增强，表明神经纤维再生长。

3.2 Zdhhc17在体外以PAT依赖性方式增强轴突再生：划痕损伤的皮层神经元中，Zdhhc17过表达显著增强轴突再生，敲低则抑制。将催化域缺失（ΔDHHC）或C457S点突变的Zdhhc17表达后，失去促再生作用，而广谱棕榈酰化抑制剂2-BP呈剂量依赖性抑制，证明PAT活性必需。

3.3 Zdhhc17以PAT依赖性方式促进SCI后功能恢复：将上述酶失活突变体在体内表达后，与空载对照类似，均不能改善行为学、电生理和组织形态，BDA示踪显示Zdhhc17可恢复皮质脊髓束纤维密度，而其突变体不能，进一步证实依赖PAT活性。

3.4 Zdhhc17结合并棕榈酰化Kpna2、Kpnb1和Ipo9：IP-MS筛选发现Zdhhc17与多种核转运蛋白结合，其中Kpna2、Kpnb1和Ipo9经反向共免疫沉淀和共定位确认。Acyl-RAC证实这三个蛋白在细胞内源水平被棕榈酰化，且表达酶失活突变体后信号显著降低，说明它们是Zdhhc17底物。

3.5 Zdhhc17介导的棕榈酰化通过抑制泛素依赖性降解稳定Kpna2和Ipo9蛋白：SCI显著降低脊髓中Kpna2和Ipo9蛋白，而Zdhhc17过表达可恢复，但mRNA不变。CHX实验显示Zdhhc17延长两者半衰期；MG132处理下，Zdhhc17减少其多聚泛素化。使用预测的棕榈酰化位点突变Kpna2 C223A和Ipo9 C606A，发现棕榈酰化减弱、泛素化增加。在体外划痕实验中，过表达野生型Kpna2或Ipo9促进轴突再生，突变体同样促进，说明通过稳定蛋白水平即可介导再生。

3.6 Ipo9和Kpna2重现Zdhhc17介导的SCI修复，Ipo9与Zdhhc17协同增强恢复：在体过表达Kpna2或Ipo9均可改善SCI大鼠行为、电生理和组织病理，其中Ipo9效果优于Kpna2。联合表达Zdhhc17+Ipo9比单独Zdhhc17产生更好恢复，而Zdhhc17+Kpna2无叠加效应。

3.7 Zdhhc17在损伤后促进神经元存活并激活促再生基因转录：在H₂O₂或谷氨酸处理的皮层神经元中，Zdhhc17过表达降低LDH释放和cleaved Caspase-3水平，并维持Kpna2/Ipo9蛋白水平。同时显著激活c-Jun、Atf3、Sox11、Gap43、Bdnf等多个促再生基因的转录，而敲低Kpna2或Ipo9则抑制这种激活。

讨论部分总结：研究人员指出，Kpna2和Ipo9是Zdhhc17的新底物，而Kpnb1蛋白水平不与SCI或Zdhhc17相关，因此未深入。在功效上，Ipo9是更关键的限速节点。研究局限性包括：未直接证明敲入棕榈酰化位点突变会影响修复，也未阐明Zdhhc17激活促再生基因的精确分子机制，