《Advanced Science》：TP53 Loss Elevates NF-κB-IFN-β-MHC-Ia Signaling to Promote NK Cell Resistance in Osteosarcoma
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TP53失活是骨肉瘤（OS）发生中的关键事件，并构成其侵袭性的基础，但其在肿瘤-免疫相互作用中的作用仍知之甚少。在本研究中，研究人员利用OS细胞系和干细胞来源的OS相关模型，探讨了p53缺失如何改变骨肉瘤对自然杀伤（NK）细胞介导的细胞毒作用的敏感性。研究人员
TP53失活是骨肉瘤（OS）发生中的关键事件，并构成其侵袭性的基础，但其在肿瘤-免疫相互作用中的作用仍知之甚少。在本研究中，研究人员利用OS细胞系和干细胞来源的OS相关模型，探讨了p53缺失如何改变骨肉瘤对自然杀伤（NK）细胞介导的细胞毒作用的敏感性。研究人员发现，在人骨肉瘤细胞系中，TP53缺失使NK细胞调节性配体失调，特别是上调MHC-Ia，从而赋予对NK细胞杀伤的抵抗性。临床样本的单细胞RNA测序显示，间充质干细胞（MSCs）与OS发生相关。利用人胚胎干细胞（hESC）来源的MSCs，研究表明TP53缺失也通过激活胞质dsDNA-NF-κB-IFN-β轴驱动MHC-Ia过表达和NK细胞抵抗。同基因小鼠模型证实，与野生型对照相比，p53缺失导致更具侵袭性的肿瘤，且NK细胞浸润减少。临床上，p53功能受损与MHC-Ia表达升高和I型IFN信号增强相关。这些发现揭示了TP53缺失触发的NF-κB-IFN-β-MHC-Ia轴有助于OS发展中的NK细胞抵抗，并强调其作为早期干预关键治疗靶点的潜力。
TP53缺失上调NF-κB-IFN-β-MHC-Ia信号通路促进骨肉瘤NK细胞抵抗
骨肉瘤（OS）是最常见的起源于间充质细胞的恶性骨肿瘤，具有高度异质性和侵袭性。肿瘤抑制基因TP53在人类OS中频繁突变，其缺失与肉瘤发生密切相关。尽管p53在肿瘤发生中的作用已被广泛研究，但其在肿瘤免疫，尤其是先天免疫监视中的作用仍不清楚。正常组织中，新转化的细胞可被免疫系统通过癌免疫监视清除，自然杀伤（NK）细胞作为先天免疫第一道屏障，通过识别靶细胞表面的激活性和抑制性配体，清除恶性和癌前细胞。p53对NK细胞易感性的调节存在争议，其在不同肿瘤类型和发育背景下的作用有待阐明。间充质干细胞（MSCs）被认为是OS的起源细胞，但TP53缺失如何影响NK细胞对MSCs的杀伤，以及这一过程在OS早期发展中的意义尚属空白。本研究旨在填补这一空白。
研究人员利用人OS细胞系（U2OS、Saos2、MG63）、人胚胎干细胞（hESC）来源的MSCs和成骨细胞模型、同基因小鼠模型及临床样本，系统研究了TP53不同状态对NK细胞易感性的影响。结果发现，TP53缺失可上调NK细胞抑制性配体MHC-Ia（主要组织相容性复合体I类a亚类），从而赋予OS细胞对NK细胞杀伤的抵抗。机制上，TP53缺失导致胞质双链DNA（dsDNA）积累，激活NF-κB信号，进而诱导I型干扰素IFN-β自分泌，最终上调MHC-Ia表达。体内实验证实p53缺失促进肿瘤生长并减少NK细胞浸润。临床样本分析也显示p53功能受损与MHC-Ia高表达及I型干扰素信号激活呈正相关。该研究揭示了一条由TP53缺失触发的NF-κB-IFN-β-MHC-Ia信号轴，为OS早期干预提供了潜在治疗靶点。
主要技术方法：研究采用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除TP53、RB1、B2M及Trp53，并通过慢病毒介导p53、TERT、c-MYC过表达。将H9 hESCs分化为神经嵴细胞、MSCs和成骨细胞。体外采用NK细胞毒性实验、流式细胞术、RNA-seq、ELISA和蛋白质印迹等。体内采用异种移植（NOD/SCID小鼠）、同基因（BALB/c小鼠）和胫骨内原位模型。单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析来自GSE152048和GSE162454数据集（含17例OS患者样本），临床验证使用GSE126209数据集和OS组织芯片。通过免疫荧光、细胞因子检测及NF-κB抑制剂QNZ处理等阐明信号通路。
研究结果包括以下部分：
2.1 P53缺失改变NK调节性配体并增加人OS细胞体外NK抵抗：通过比较不同TP53状态的OS细胞系，发现TP53缺失细胞（Saos2、MG63）表面HLA-Ia表达更高，对NK细胞杀伤更具抵抗性。在U2OS细胞中敲除TP53后，HLA-Ia表达升高，NK抵抗增强，且NK细胞分泌的颗粒酶B和IFN-γ减少。RNA-seq显示TP53缺失细胞中I型干扰素信号通路富集，NK抑制性配体上调、激活性配体下调。B2M敲除可降低HLA-Ia并恢复NK敏感性，而p53过表达可部分逆转NK抵抗，表明HLA-Ia参与介导NK抵抗。
2.2 P53缺失促进体内NK抵抗和OS肿瘤建立：将表达荧光素酶的OS细胞与NK细胞共注射入NOD/SCID小鼠，TP53缺失细胞在NK细胞存在下保留更高的生物发光信号，说明其对NK清除更具抵抗性。皮下和胫骨内模型均显示p53缺失促进肿瘤形成。
2.3 P53缺失在同基因小鼠中促进OS并减少NK细胞浸润：通过在小鼠K7M2细胞中敲除Trp53，接种BALB/c小鼠后，p53缺失组肿瘤体积更大，胫骨内模型肿瘤发生率更高，且肿瘤内NK细胞浸润显著减少，而T细胞浸润无显著差异。
2.4 scRNA-seq提示OS的MSC相关细胞起源及其与NK细胞的相互作用：分析17例OS患者的scRNA-seq数据，鉴定出14个主要细胞群。结果显示MSCs与成骨细胞具有最高相似性，且MSCs携带较高拷贝数变异负荷，提示其可能为OS的起源细胞。细胞通讯分析显示，p53功能低的细胞群与NK细胞的相互作用信号较弱，提示p53影响OS相关细胞与NK细胞的通讯。
2.5 生成并鉴定TP53缺失hESC来源的MSCs用于OS建模：在H9 hESCs中敲除TP53，确认其维持多能性且无脱靶，但出现非整倍体。进一步敲除RB1并过表达TERT和c-MYC后，TP53缺失MSCs获得锚定非依赖性生长能力，其分化的成骨细胞在体内形成具有OS特征的肿瘤。
2.6 TP53缺失MSCs通过IFN-β介导的HLA-Ia上调抵抗NK免疫：与TP53+/+ MSCs相比，TP53?/? MSCs表面HLA-Ia表达更高，NK细胞杀伤能力降低，NK细胞分泌颗粒酶B和IFN-γ减少。RNA-seq显示I型干扰素通路富集，IFNB1表达及IFN-β分泌增加。外源IFN-β处理可剂量依赖性上调HLA-Ia，抗IFN-β中和抗体则可阻断该效应，证实IFN-β的自分泌作用。
2.7 胞质dsDNA相关NF-κB信号促进IFN-β表达和HLA-Ia介导的NK抵抗：TP53?/? MSCs中胞质dsDNA积累增加，核酸传感相关基因（如CGAS、TLR9、RIGI等）表达上调，但STING-TBK1-IRF3通路无明显激活，而NF-κB磷酸化水平升高。NF-κB抑制剂QNZ处理可降低IFN-β分泌和HLA-Ia表达，并恢复NK细胞杀伤敏感性，在MG63细胞中也观察到类似现象。
2.8 人OS样本中验证p53功能与HLA-Ia表达的负相关：分析GSE126209数据集，将OS样本分为TP53_WT和TP53_LOF组，发现TP53_LOF组中I型干扰素通路和HLA-Ia基因表达增加。人OS组织芯片免疫组化染色显示p53表达与HLA-Ia表达呈负相关。
讨论部分指出，本研究与既往报道存在差异，可能源于实验方法和细胞背景不同。研究还发现，TP53缺失MSCs中IFN-β的产生不依赖经典的cGAS-STING通路，而是通过NF-κB直接驱动。这些结果凸显了p53在不同细胞类型中功能的多样性。研究结论认为，p53缺失激活胞质dsDNA-NF-κB-IFN-β-HLA-Ia信号轴，导致HLA-Ia上调和NK细胞抵抗，从而促进OS发展。该轴有望成为TP53缺失型OS的早期干预靶点，联合NK细胞治疗可能改善疗效。
