黏附增强的工程益生菌用于延长肠道滞留及钙卫蛋白响应性炎症性肠病(IBD)治疗

《Advanced Science》：Adhesion-Enhanced Engineered Probiotic for Prolonged Intestinal Retention and Calprotectin-Responsive IBD Therapy

　　

工程益生菌在炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）中的临床转化受到肠道滞留时间有限和炎症响应精准性不足的阻碍。本研究采用表面展示策略构建了一种黏附增强的大肠杆菌Nissle 1917（Escherichia coli Nissle 1917）底盘。通过冰核蛋白系统展示源自鼠李糖乳杆菌GG（Lactobacillus rhamnosus GG）的截短型SpaC黏附素，该工程菌株实现了增强的黏膜锚定和延长的肠道滞留。为实现自主响应，该益生菌平台整合了钙卫蛋白响应性ykgMO启动子，以驱动CAT-SOD-GPx三部分融合系统（tripartite fusion system, TFS）和人三叶因子3（trefoil factor 3, TFF3）的分泌。在TFS中，CAT和SOD介导活性氧（reactive oxygen species, ROS）清除，而GPx被认为充当非催化性结构支持组件，与改善折叠和可溶性表达相关。结合pH响应的Eudragit L100-55微囊化以确保胃部存活，这一可编程系统在预防性和治疗性小鼠结肠炎模型中有效缓解炎症、恢复上皮屏障完整性并逆转氧化损伤。此外，该平台通过抑制机会性病原菌（如埃希菌-志贺菌属（Escherichia-Shigella））同时促进有益类群（包括毛螺菌科（Lachnospiraceae））的复苏，重塑肠道菌群。总之，这种生物标志物响应策略为IBD急性发作期间的精准管理提供了一个多功能且可编程的框架。

炎症性肠病（IBD）是累及胃肠道的慢性复发性炎症疾病，现有治疗手段如氨基水杨酸盐、皮质类固醇及抗肿瘤坏死因子（TNF）单抗存在全身毒性、免疫抑制和无法纠正菌群失调等局限。工程益生菌作为活体生物治疗产品（LBP）为IBD提供了局部治疗策略，但大肠杆菌Nissle 1917（EcN）等底盘菌因肠道滞留差、易被腹泻冲刷和定植抵抗清除，导致疗效窗口狭窄。因此，开发基因编码的可遗传黏附策略并整合炎症响应性治疗模块，是提升LBP疗效的关键。本研究构建了表面展示截短SpaC黏附素（tSpaC）的EcN底盘，并整合钙卫蛋白响应性启动子驱动的抗氧化与黏膜修复模块，旨在实现IBD急性发作的精准干预。该成果发表于《Advanced Science》。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：利用冰核蛋白（INPN）系统将鼠李糖乳杆菌GG来源的截短SpaC展示于EcN外膜，并通过诱导型启动子与蛋白质截短优化表达稳定性；构建钙卫蛋白响应性ykgMO启动子驱动的CAT-SOD-GPx三部分融合系统（TFS）和YebF-TFF3分泌模块；使用Eudragit L100-55对工程菌进行pH响应性微囊化以耐受胃酸；在C57BL/6小鼠中建立葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的预防性和治疗性结肠炎模型，结合16S rRNA基因测序评估肠道菌群变化。

研究结果如下：

2.1 通过SpaC表面展示构建黏附增强EcN：系统筛选表面展示架构后发现，组成型表达SpaC造成严重代谢负担和遗传不稳定；采用L-阿拉伯糖诱导的araBAD启动子并截短SpaC为tSpaC（50.6 kDa）后，INPN系统成功将tSpaC锚定于EcN外膜，且诱导表达会部分抑制生长，证实了严格调控的必要性。

2.2 tSpaC增强黏附与肠道滞留：体外实验显示，与对照菌相比，EcN-EB2对黏蛋白、IV型胶原和Caco-2细胞单层的黏附分别增强4.79倍、6.86倍和11.87倍。健康小鼠中，EcN-EB2仅将粪便清除时间延长24小时；而在DSS诱导的炎症结肠组织中，其结合容量显著增加，饱和剂量从健康组织的1×10⁶ CFU升至1×10⁷ CFU，表明炎症靶向富集能力。

2.3 系统性生物安全分析：健康小鼠连续7天口服EcN-EB2后，体重、血液学指标、主要脏器组织学均无异常，且未在肝、脾、肾等肠外器官检出活菌，证明该平台具备良好生物相容性。

2.4 钙卫蛋白响应性基因电路：重组钙卫蛋白（S100A8/S100A9）可剂量依赖地激活ykgMO启动子（最高11.54倍）。筛选抗氧化融合构建体时发现，CAT-SOD双酶融合体可溶性差，而引入GPx形成TFS后溶解度显著改善；TFS(Bs)的CAT和SOD活性较对应的双酶形式分别提高3.28倍和2.62倍。EcN-EB4在400–800 μg/mL钙卫蛋白诱导下可分泌YebF-TFF3。

2.5 微囊化提高胃肠道存活：Eudragit L100-55包被使细菌表面形成皱褶外壳，粒径和Zeta电位显著变化。在模拟胃液中包被菌活菌数提高一个数量级，在模拟肠液中快速释放；流式细胞术证实包被后tSpaC阳性率在消化后恢复至74.98%，保护了黏附功能。

2.6 治疗性疗效：在延迟治疗DSS模型中，EB4及EB4@L100-55显著抑制体重下降、降低疾病活动指数（DAI），恢复结肠长度和脾脏重量，降低肠道通透性，减轻组织病理损伤，并促进紧密连接蛋白（Claudin、Occludin、ZO-1）的连续分布。细胞因子分析显示，治疗组下调促炎因子（IL-17A、TNF-α等）并上调TGF-β。

2.7 治疗模型肠道菌群调节：16S rRNA测序显示，EB4@L100-55恢复α多样性，使菌群β多样性向健康状态迁移，抑制埃希菌-志贺菌（Escherichia-Shigella）等病原菌，富集毛螺菌科（Lachnospiraceae_NK4A136），并显著回升粪便丁酸水平。

2.8 预防性疗效：在DSS诱导早期给药，EB4@L100-55稳定体重、降低DAI至接近健康对照，维持结肠长度和脾重，恢复屏障完整性，并显著上调IL-10和TGF-β。

2.9 预防模型肠道菌群调节：益生菌干预逆转DSS导致的多样性下降，抑制大肠杆菌-志贺菌和肠球菌（Enterococcus），富集Lachnospiraceae_NK4A136、乳杆菌（Lactobacillus）等，并防止丁酸耗竭。

2.10 模块化评估及与标准疗法比较：包被材料本身无治疗作用；未诱导tSpaC的EB4(L-ara-)疗效显著低于诱导组，证明黏膜锚定是治疗的必要前提；EB4@L100-55在体重、DAI、结肠长度、细胞因子等指标上与一线药物5-氨基水杨酸（5-ASA）疗效相当。

2.11 系统生物安全与自限性清除动力学：健康小鼠和结肠炎小鼠中均未观察到细菌易位。清除动力学显示，治疗菌株EcN-EB4和EB4@L100-55在停药后清除速率常数分别为0.961 d^?1和1.083 d^?1，约为非治疗菌株EcN-EB2（0.447 d^?1）的2.15倍和2.42倍，提示疾病缓解后治疗菌株可被更快清除。

讨论部分指出，该研究首次实现革兰氏阳性菌来源SpaC黏附素在革兰氏阴性EcN表面的功能性展示，通过跨物种表面展示、诱导型表达和蛋白质截断解决了表达不稳定问题；tSpaC同时识别黏液和暴露的细胞外基质，赋予炎症靶向滞留能力。钙卫蛋白作为临床IBD严重程度金标准生物标志物，实现了治疗输出的定量校准。GPx虽无催化活性，但可能作为非催化结构稳定剂促进融合蛋白可溶性表达。菌群分析表明平台通过竞争性抑制病原菌和恢复有益菌代谢功能，实现微生态重建。

研究结论可概括为：通过整合跨物种表面展示、炎症响应性逻辑和TFS抗氧化模块，研究成功克服了微生物疗法的主要瓶颈，建立了高性能LBP工程范式。这一可编程益生菌平台在IBD急性发作的精准管理中具有重要转化潜力。