运动诱导的肌联素保护脑缺血-再灌注损伤

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Exercise-Induced Myonectin Protects Against Cerebral Ischemia–Reperfusion Injury

　　

背景：存在经由肌因子（myokine）的肌肉-脑信号传导。然而，并非所有肌因子成员均已被充分研究。研究人员在此将运动诱导的肌联素（myonectin/CTRP15）鉴定为脑缺血-再灌注（I/R）损伤的新调节因子。方法：通过中脑动脉阻塞/再灌注（MCAO/R）在野生型小鼠与骨骼肌特异性肌联素敲除小鼠中诱导脑缺血；采用激光散斑对比成像（LSCI）与2,3,5-三苯基四唑氯化物（TTC）染色评估脑损伤；利用HT22与BV2细胞经氧-糖剥夺/复氧（OGD/R）模拟I/R相关细胞损伤；静脉注射重组肌联素以评估对I/R损伤的治疗效应；免疫组化、TUNEL、酶联免疫吸附测定（ELISA）与蛋白质印迹（Western blotting）用于检测细胞与组织形态及分子变化。结果：运动提高野生型小鼠血清与脑内肌联素并减小梗死体积与神经元损伤，而在肌联素缺陷小鼠中无此效应；系统性给予肌联素显著保护脑I/R损伤；机制上，肌联素通过激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制过度自噬性凋亡与小胶质细胞介导的神经炎症发挥神经保护作用。结论：骨骼肌来源的肌联素通过肌肉-脑交流保护脑免受I/R损伤，并可能作为脑I/R损伤的有前景治疗剂。

研究背景：卒中是全球死亡与致残主因，其中缺血性卒中占60%–70%。当前治疗限于静脉溶栓与血管内取栓，而短暂脑缺血后再灌注虽可挽救缺血组织，却会放大细胞损伤并诱发脑缺血-再灌注（I/R）损伤。已知运动训练具脑保护效益，骨骼肌可分泌肌因子（myokine，肌肉来源可进入循环并作用于远隔器官的分泌因子）参与肌肉-脑交流，如cathepsin B、FNDC5/irisin、IGF-1等。肌联素（myonectin，亦称CTRP15、erythroferrone/Erfe）属C1q/TNF相关蛋白（CTRP）家族第15成员，运动可上调其循环水平，并已被报道减轻心肌I/R损伤，但是否参与脑保护此前不明。研究人员由此开展本研究，论文发表于《CNS Neuroscience》。

主要关键技术方法：研究人员使用6–8周雄性C57BL/6J野生型小鼠、Erfe^flox/flox对照鼠与Myf5-Cre;Erfe^flox/flox骨骼肌特异性肌联素敲除（Myo-mKO）鼠；以线栓法建立中脑动脉阻塞/再灌注（MCAO/R，阻塞60分钟后再灌注24小时）模型，部分野生型鼠在术前30天每日跑台运动90分钟（10米/分钟）作为运动预适应；细胞实验采用小鼠海马神经元HT22与小胶质BV2细胞进行氧-糖剥夺/复氧（OGD/R）；体内治疗组在缺血前30分钟尾静脉单次注射重组肌联素（200微克/千克）；检测方面依托激光散斑对比成像（LSCI）、TTC染色、H&E、尼氏（Nissl）染色、免疫组化、TUNEL、ELISA、蛋白质印迹、流式细胞术与荧光染色，并以PI3K抑制剂LY294002、mTOR抑制剂rapamycin、自噬抑制剂3-MA作机制阻断验证。

研究结果：

3.1 耐力运动通过肌联素参与脑梗死减轻效应：研究人员比较假手术、假手术+跑步、MCAO/R、MCAO/R+跑步组，发现跑步上调血清与脑肌联素（脑内约2.28倍、血清约1.78倍），神经功能缺损评分降低约47.4%，再灌注后同侧脑血流恢复更好，TTC梗死体积减少40.6%，H&E显示病理损伤减轻，且肌联素水平与神经评分呈显著负相关，说明耐力运动诱导的肌联素升高与脑I/R保护相关。

3.2 运动在小鼠脑I/R损伤中发挥神经保护：TUNEL见跑步使凋亡细胞减少5.13倍；尼氏小体在海马CA1–CA4与齿状回（DG）损失被逆转并增加69.6%；NeuN阳性神经元增多；Iba-1显示小胶质激活被抑、阳性细胞降43.4%；血清IL-6、IL-1β分别降41.7%、58.4%，表明运动通过抑神经元凋亡与神经炎症保护脑。

3.3 肌源性肌联素缓解脑I/R损伤：基因型与qRT-PCR证实Myo-mKO仅在骨骼肌删去Erfe，脑与比目鱼肌肌联素蛋白下降，体重/脑重/血红蛋白正常。运动后Myo-mKO神经评分升2.2倍、梗死体积增52.2%、皮质水肿与神经元丢失更重；野生型鼠静脉给重组肌联素则梗死体积显著缩小，证明肌源肌联素介导运动益处且外源肌联素有治疗价值。

3.4 肌源性肌联素抑制神经元凋亡与小胶质炎症：Myo-mKO运动后TUNEL阳性细胞多于Flox，尼氏小体在海马各亚区丢失，皮质NeuN阳性神经元更少，Iba-1阳性细胞增47%，血清IL-6、IL-1β、TNF-α升高，说明缺失肌联素后运动不再具神经保护，肌联素为抑凋亡与抑小胶质炎症所必需。

3.5 肌联素减轻自噬诱导的神经元凋亡与小胶质激活：在HT22中，OGD/R增加自噬体（MDC荧光）、Beclin-1、LC3-II/I并降p62，活性氧（ROS）升81.23%，线粒体膜电位（ΔΨm）下降；肌联素（5、10微克/毫升）恢复p62、抑Beclin-1与LC3转换，ROS分别降76.4%与84.4%，JC-1单体比例降至约11%，Annexin V/PI凋亡被抑，Bcl-2/Bax改善，存活率升2.15与2.51倍；3-MA抑制自噬后趋势与肌联素一致。BV2中肌联素浓度依赖地下调Iba-1与磷酸化NF-κB p65，ELISA示IL-6、IL-1β约降42%与64%，表明肌联素抑神经元过度自噬凋亡并抑小胶质炎症。

3.6 肌联素经PI3K/Akt/mTOR信号发挥神经保护：OGD/R抑PI3K/Akt/mTOR磷酸化、升p-AMPK、降p-ERK1/2与p53，肌联素仅回补PI3K/Akt/mTOR而不改AMPK/ERK/p38/p53轴。LY294002与rapamycin取消肌联素对p62、Beclin-1、LC3、XIAP、ROS、线粒体损伤、凋亡的改善；BV2中亦取消对Iba-1与p-p65的抑制。体内运动组脑内p-PI3K/Akt/mTOR升高、Beclin-1降、p62升，免疫组化见p-AKT与p62恢复，确证肌联素经PI3K/Akt/mTOR抑自噬、凋亡与小胶质炎症。

讨论总结：研究人员指出，肌联素既往被证可经S1P/cAMP/Akt保护心肌并抑巨噬炎症，本文在OGD/R神经元与小胶质模型中主要归因为PI3K/Akt/mTOR，差异来自细胞环境与模型不同。PI3K/Akt/mTOR激活可抑Beclin-1与LC3转换、减轻神经炎症与氧化应激（如Nrf2、SOD、GSH、GPx上调与MDA降低）。运动升脑肌联素未必由I/R破坏血脑屏障（BBB）渗漏所致，因假手术跑步鼠脑与血清肌联素已升高；肌联素或像脂联素（adiponectin）般跨BBB入脑，但转运体未明。肌联素与adiponectin同源，但是否共用AdipoR1/AdipoR2未知，体内主要靶细胞与受体需后续以受体阻断与条件性基因小鼠论证。

结论部分翻译：骨骼肌来源的肌联素通过肌肉-脑交流保护脑免受I/R损伤，构成运动获益的一部分。肌联素可作为脑I/R损伤的有前景治疗剂。研究人员首次表明，外源重组肌联素蛋白可有效减轻缺血性脑损伤，凸显其治疗潜力。