空间转录组学鉴定特应性皮炎中的特征性免疫生态位

《Allergy》：Spatial Transcriptomics Identifies Characteristic Immunological Niches in Atopic Dermatitis

　　

背景：特应性皮炎（AD）主要由2型免疫反应驱动，辅助性T细胞（TH2）产生白细胞介素-4（IL-4）和白细胞介素-13（IL-13），从而促进炎症、瘙痒和皮肤屏障受损。然而，人类AD皮肤中致病性免疫细胞的空间组织及其与基质和上皮区室的相互作用仍不完全清楚。
方法：研究人员对来自AD患者（n=6）、银屑病患者（n=2）和健康对照（n=5）的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）皮肤活检样本进行了10× Genomics Visium空间转录组学分析。数据与AD单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集整合，并通过成像质谱流式（IMC）和多重免疫荧光（IF）进行补充，以验证免疫细胞的空间定位。细胞间通讯分析揭示了免疫生态位内推测的信号相互作用。
结果：空间聚类解析了组织区室，并证明AD和银屑病中角质形成细胞的转录失调。AD皮损在浅表真皮内表现出保守的免疫聚集体空间组织。scRNA-seq特征整合揭示了T细胞和成熟迁移性树突状细胞（mmDCs）的空间组织化共定位。研究人员开发了一种基于环的邻域分析来表征免疫-基质生态位的细胞组织，揭示了以炎症成纤维细胞和活化角质形成细胞包围的T细胞富集区域。细胞间通讯分析进一步确定了mmDC-T细胞生态位内可能促进致病性T细胞募集和激活的推测性信号。应用三级淋巴结构（TLS）特征表明存在TLS样区域。IMC和IF验证了活化TH2细胞与mmDCs之间的紧密空间邻近性。
结论：AD皮损在真皮-表皮交界处包含空间组织化的TLS样免疫生态位，其特征在于T细胞与mmDCs的紧密关联以及与周围基质和上皮区室的协调相互作用。这些mmDC-T细胞生态位可能代表未来治疗策略的潜在靶点，旨在破坏持续存在的局部炎症通路并改善长期疾病控制。

特应性皮炎（AD）是一种慢性复发性炎症性皮肤病，以剧烈瘙痒、表皮屏障功能障碍和优势2型免疫反应为特征。尽管靶向IL-4Rα的dupilumab等新型生物制剂取得临床成功，但许多患者仍出现不完全应答或快速复发，提示皮肤中可能存在残留的致病性免疫状态和空间组织化的炎症生态位。单细胞RNA测序（scRNA-seq）已揭示了AD的细胞异质性，鉴定了产生IL13、IL22和IL26的扩增TH2/TH22细胞，以及表达CCL17、CCL22和LAMP3的成熟树突状细胞和炎症成纤维细胞。然而，单细胞转录组方法丢失了空间背景，限制了对细胞间原位相互作用的理解。已有空间转录组研究初步描绘了AD中的成纤维细胞和巨噬细胞空间分布，但尚未系统解析转录定义的致病性免疫细胞状态（尤其是成熟迁移性树突状细胞（mmDC）-T细胞相互作用）以及免疫-基质生态位的分子结构。因此，研究人员开展本研究，旨在应用10× Genomics Visium空间转录组学、成像质谱流式（IMC）和多重免疫荧光（IF），整合scRNA-seq参考数据集，定义AD皮损中免疫细胞的空间微解剖组织，揭示mmDC-T细胞免疫生态位及其与周围基质和上皮区室的通讯网络。该研究发表于《Allergy》。

在关键技术方法方面，研究人员从BioIVT获取AD（n=6）和健康对照（n=3）的FFPE皮肤活检组织，从汉诺威医学院（MHH）获取银屑病（n=2）和健康对照（n=2）活检组织。主要技术包括：基于10× Genomics Visium平台的空间转录组测序，使用SpaceRanger处理数据并整合多个AD scRNA-seq数据集进行细胞类型推断；开发了基于环的空间邻域分析方法，用于分析免疫浸润周围多细胞尺度的转录梯度；利用IMC标记CD3、CD4、CD8、CLA、HLA-DR等蛋白，以及多重IF标记CD4、CD69、LAMP3进行蛋白水平验证；通过CellChat进行细胞间通讯预测，并应用Reactome通路和三级淋巴结构（TLS）特征评分。

研究结果分为以下部分：

**3.1 空间聚类反映皮肤结构**：通过无监督聚类，空间转录组学（ST）数据解析出表皮、真皮、皮下组织和附属器结构（毛囊、皮脂腺、汗腺），并可区分基底层、棘层、角化层角质形成细胞。AD皮损表皮厚度（0.1–1 mm）显著大于健康对照（0.04–0.2 mm）。

**3.2 差异基因表达分析揭示角质形成细胞的主要改变**：比较炎症皮损与健康皮肤，AD和银屑病中前100个差异表达基因（DEGs）大部分来自角质形成细胞，证实炎症性皮肤病中表皮的显著激活，也验证了ST数据的生物学有效性。

**3.3 AD皮损中免疫细胞的空间组织**：利用已发表的AD scRNA-seq数据集定义T细胞（94个特征基因，如CD96、CD3E、CD247）、mmDCs（148个特征基因，如CCL22、LAMP3、NCCRP1）和巨噬细胞（65个特征基因，如CCL18、CCL13、LILRB5）的特异性基因签名。将签名映射到ST数据后发现，免疫细胞在真皮-表皮交界下方和附属器周围形成聚集。T细胞与mmDCs呈现共定位，而巨噬细胞弥漫分布于浅表真皮。银屑病样本中也观察到类似共定位，但样本量有限。

**3.4 免疫生态位的空间邻域分析**：针对Visium点阵含多个细胞的特性，研究人员开发了七层同心环状邻域分析方法，对AD1和AD2的免疫浸润区域进行分析。结果显示T细胞和mmDCs富集于中心，随距离增加逐渐减少；炎症成纤维细胞和有丝分裂角质形成细胞在外围增加。T细胞相关基因（CCR4、CD3D、CD3E、CD4）在中心高表达，mmDC相关基因（LAMP3、CCR7、CD1C、IRF7）也集中于内环，而成纤维细胞标志（COL1A2、DCN）和角质形成细胞标志（KRT1、KRT16、S100A8）向外围递增，CCL19例外。这揭示了免疫核心被基质和上皮细胞包裹的有序结构。

**3.5 空间富集T细胞激活通路和TLS样信号**：使用Reactome通路评分，发现T细胞受体（TCR）信号、CD28家族共刺激、IL-4/IL-13信号通路在免疫聚集区域显著富集，且与T细胞和mmDC共定位区域高度重叠。应用TLS相关50基因和12趋化因子特征（来自Tang等），检测到TLS样信号在多个AD样本的免疫生态位中强表达，而周围区域低表达。银屑病中这些富集较弱，需大样本验证。

**3.6 IMC和IF验证蛋白水平共定位**：IMC分析显示CD3⁺CD4⁺CD8^? T细胞在浅表真皮形成密集簇，多数表达皮肤归巢标志物CLA，HLA-DR⁺抗原呈递细胞与CD4⁺ T细胞空间重叠。多重IF进一步显示LAMP3⁺树突状细胞富集于CD4⁺CD69⁺ T细胞区域，验证了mmDCs与活化T细胞的密切空间关联。

**3.7 免疫-基质生态位内细胞串扰**：CellChat分析显示AD样本的预测细胞通讯强度高于健康对照，成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞和免疫细胞表现出增强的传出信号，基底和棘层角质形成细胞传入信号增强。mmDCs是CCL17和CCL22的主要来源，可招募CCR4⁺ T细胞；炎症成纤维细胞主要产生CCL19，结合CCL21可能招募CCR7⁺ mmDCs；mmDCs表达CD80、CD86等共刺激分子；T细胞通过CSF2和FLT3L信号作用于mmDCs；T细胞表达IL13，与mmDCs、活化角质形成细胞和血内皮细胞形成预测相互作用。此外，在两个独立scRNA-seq数据集中未检测到成熟DC的OX40L表达，预测的OX40-OX40L相互作用主要涉及淋巴内皮细胞而非DC-T细胞。

讨论部分总结：本研究结合空间转录组学、蛋白水平验证和空间邻域分析，证明AD免疫浸润并非弥漫分布，而是形成空间保守的免疫生态位，结构与可诱导性皮肤相关淋巴组织（iSALT）概念一致。这些生态位可能作为局部免疫反应平台，促进T细胞激活和2型炎症持续。研究还提出DC-T细胞轴是慢性AD的关键组织者，靶向该轴可能成为超越细胞因子阻断的补充治疗策略。然而，研究存在样本量有限、Visium多细胞分辨率需要推断等局限性，未来需更大队列纵向研究及功能实验验证。

结论：研究揭示了AD皮损中位于真皮-表皮交界处的保守空间免疫生态位，其特征是CD4⁺ T细胞与mmDCs的紧密相互作用，并具有综合性基因表达特征而非单一标志物。通过整合空间转录组学、多重成像验证和新开发的环状邻域分析，发现这些免疫聚集体具有明确的微解剖结构，以T细胞为中心，周围环绕炎症基质和上皮区室。细胞通讯分析确定了mmDCs、T细胞和周围基质细胞之间的推测信号网络。TLS样转录特征和局部T细胞激活信号的存在提示致病性T细胞激活可能直接发生在皮肤内。这些发现为AD中2型炎症的空间组织提供了新见解，并强调持续性mmDC-T细胞免疫生态位可能是慢性疾病活动和复发的驱动因素。靶向维持这些空间组织化生态位的细胞相互作用可能成为减少复发的补充策略，但需未来纵向和功能研究评估其稳定性和治疗潜力。