整合单细胞多组学分析揭示梨状皮层主神经元异质性及其在阿尔茨海默病中的选择性易感性

《Clinical and Translational Medicine》：Integrative analysis of single-cell multi-omics reveals heterogeneity in piriform cortex principal neurons and their selective vulnerability in Alzheimer's disease

　　

摘要 背景：梨状皮层（PIR）是嗅觉系统的关键区域，且日益被认为与阿尔茨海默病（AD）相关。然而，该区域主神经元（PN）的细胞异质性及其在AD中的选择性易感性仍知之甚少。 方法：在此，研究人员整合了单细胞多组学数据集，以系统性地表征PIR PN异质性。研究人员鉴定出四种转录及表观遗传学上截然不同的PN亚型，它们在前部和后部PIR中具有不同的空间分布。 结果：在AD小鼠模型中，Reln阳性浅层（Reln+ SL）亚型的丰度与淀粉样蛋白-β（Aβ）病理在空间上相关，其比例降低已通过多重免疫荧光证实。跨区域比较揭示，Reln+ SL神经元与内嗅皮层（EC）中易感的第II层兴奋性神经元共享一个Gpc5-高/Sort1-低的分子特征。在人类AD中，该易感性相关特征在Braak分期I–III中于EC第II层神经元中呈现进行性富集。此外，一个包含Sort1的共表达模块捕获了外侧与内侧EC第II层群体之间的区域差异，并富集了蛋白质稳态相关通路。 结论：这些发现揭示了PIR与EC第II层神经元之间与选择性易感性相关的共享分子特征，并鉴定出一个与AD期间神经元易感性区域差异相关的蛋白质稳态相关程序。 关键要点： •单细胞多组学揭示了梨状皮层主神经元间的分子异质性。 •Reln+浅层神经元在AD中表现出选择性易感性。 •跨区域比较鉴定出EC和PIR易感第II层神经元中共享的Gpc5-高/Sort1-低特征。

论文解读：整合单细胞多组学揭示梨状皮层主神经元异质性及其在阿尔茨海默病中的选择性易感性

一、研究背景与科学问题

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）的核心病理特征之一是特定神经元群体的选择性易感性，不同神经元群体对病理性蛋白聚集物积累和神经元变性的易感程度呈现梯度差异。内嗅皮层（entorhinal cortex, EC）是AD中最早出现萎缩和神经元丢失的皮层区域之一，与记忆损伤密切相关。其中，外侧内嗅皮层（lateral entorhinal cortex, LEC）主要参与嗅觉信息处理，在AD中比内侧内嗅皮层（medial entorhinal cortex, MEC）更早出现萎缩。EC第II层神经元，尤其是Reelin阳性的谷氨酸能细胞，对AD病理高度易感，并在疾病早期即发生死亡。

近年来的单细胞研究进一步鉴定出EC特定层中在AD中耗竭的额外易感兴奋性神经元群体，提示选择性易感性与神经元群体异质性相关。然而，这些群体是否具有与易感性相关的独特分子特征，特别是EC第II层易感神经元与其他层神经元之间的差异，仍不清楚。阐明这些问题对于理解AD早期阶段发生的选择性神经元变性至关重要。

梨状皮层（piriform cortex, PIR）是嗅觉系统的关键区域，与EC在解剖和功能上密切相关。在人类中，浅层LEC接收来自PIR的输入。此外，嗅觉缺陷是AD最早的临床表现之一，内侧颞叶嗅觉区域（包括PIR）中可检测到早期病理积累，并在疾病进展中出现功能紊乱。鉴于EC与PIR的解剖和功能相关性及其在AD中的紊乱，研究人员提出PIR中的Reelin阳性神经元可能与LEC第II层神经元类似，在AD早期阶段易感。这种共享的易感性可能反映了区分嗅觉皮层回路中这两个群体与相对耐受神经元群体的保守分子特征。

既往研究主要关注PIR中表达钙网膜蛋白或生长抑素的中间神经元对淀粉样蛋白-β（amyloid-beta, Aβ）积累的易感性，而兴奋性神经元是否表现出亚型特异性易感性在很大程度上尚未被探索。单细胞技术的最新进展和大型多组学数据的快速积累为深入探讨这一问题提供了新的机遇。

二、研究内容与主要发现

研究人员基于上述背景，对小鼠PIR中的主神经元（principal neurons, PN）进行了整合性单细胞多组学分析，鉴定出四种转录和表观遗传学上截然不同的PN亚型，并系统表征了其空间分布、细胞环境和投射靶标。在AD小鼠模型中，研究人员发现Reln阳性浅层（Reln+ SL）亚型与Aβ病理在空间上相关，其比例在AD小鼠脑中降低。通过跨区域比较，研究人员鉴定出PIR与EC第II层易感神经元共享的Gpc5-高/Sort1-低分子特征。进一步分析发现，一个包含Sort1的共表达模块可区分LEC与MEC第II层群体，并富集蛋白质稳态相关过程。这些发现增进了对AD中选择性神经元易感性分子特征的理解。

三、主要技术方法

研究人员整合了多个公开可用的单细胞多组学数据集，涵盖七种组学技术：单细胞核RNA测序（snRNA-seq）、单细胞核转座酶可及性染色质测序（snATAC-seq）、单细胞核甲基胞嘧啶测序（snmC-seq2）、表观遗传逆行示踪测序（epi-retro-seq）、10X Genomics空间转录组（Visium）、高分辨率空间增强分辨率组学测序（Stereo-seq）和多重抗错荧光原位杂交（MERFISH）。样本来源包括AD小鼠模型（野生型、5XFAD、App^NL-G-F；6周至18月龄）和具有Braak分期的人类尸检组织。此外，研究人员还使用5XFAD和野生型小鼠（20周和50周龄）进行了多重免疫荧光染色验证。

四、研究结果

4.1 梨状皮层主神经元的分子异质性

4.1.1 小鼠PIR中四种转录上不同的PN亚型

研究人员通过重新分析已发表的包含26,975个正常小鼠PIR细胞核的snRNA-seq数据集，鉴定出四种转录上不同的PN亚型。浅层（SL）群体以Ntng1表达为标志，包含富集于前部PIR（aPIR）的Reln+神经元和富集于后部PIR（pPIR）的Rab3b+神经元。锥体（PYR）群体以Abi3bp或Ncam2表达为特征，且高表达Slc30a3。多重免疫荧光证实了这些亚型标志物的空间分布差异。通过将PIR snRNA-seq数据与全小鼠脑参考图谱进行典型相关分析（CCA）整合，研究人员确认了这四种转录组PN亚型与已注释的PIR-外侧内嗅区（ENTl）群体之间的对应关系。

4.1.2 与PN亚型相关的表观基因组特征

研究人员利用两个公开的小鼠PIR单细胞表观遗传图谱（scATAC-seq和snmC-seq2），发现Reln、Rab3b、Abi3bp和Ncam2在无监督表观基因组聚类中表现出不同的染色质可及性和非CG甲基化（mCH）水平。通过差异可及性分析，研究人员鉴定出Rorb和Nfib分别作为Rab3b+ SL和Ncam2+ PYR神经元的亚型相关转录因子，两者均显示出亚型富集的染色质可及性和RNA表达。

4.1.3 PN亚型分布的空间差异

利用高分辨率空间转录组数据集，研究人员揭示了PN亚型间不同的层状偏好。Abi3bp+ PYR神经元占据第IIa和IIb层，Ncam2+ PYR神经元优先定位于靠近第III层的IIb层，而Reln+和Rab3b+ SL神经元主要富集于IIa层。全脑空间转录组图谱的反卷积分析显示，Rab3b+ SL和Abi3bp+ PYR神经元在后部PIR区域优先富集。

4.1.4 PN亚型的独特细胞环境和投射靶标

空间相关性分析揭示了PN亚型与胶质群体之间的不同关系。投射分析显示，SL神经元与纹状体靶标优先相关，而PYR神经元与主嗅球投射更相关，支持转录组身份与投射组织之间的对应关系。

4.2 EC第II层样Reln+ SL群体在AD中选择性易感

4.2.1 Reln+ SL丰度与AD中Aβ病理在空间上相关

通过将PIR PN snRNA-seq数据与小鼠脑等皮层图谱进行CCA整合，研究人员发现Reln+ SL神经元与EC第II层外侧内嗅区神经元（L2 ENTl）共聚类。在AD小鼠模型的空间转录组数据集中，Reln+ SL丰度与Aβ负荷呈显著正相关。多重免疫荧光证实AD小鼠PIR中Reln+ SL神经元比例在50周龄时显著降低。

4.2.2 AD模型中与Reln+ SL相关的细胞微环境

在AD样本中，Reln+ SL高丰度斑点中富集的基因显著富集核糖体和溶酶体相关通路，以及巨噬细胞活化和氧化应激相关通路。细胞间通讯分析鉴定出AD中Grn–Sort1和Spp1–Cd44信号相互作用增强，小胶质细胞是主要信号发送者，而Reln+ SL神经元是表达Sort1和Cd44的预测接收者。

4.3 与Reln+ SL在AD中易感性相关的分子特征

4.3.1 正常梨状皮层和内嗅皮层中Reln+第II层神经元共享Gpc5-高和Sort1-低表达

研究人员比较了正常小鼠脑中已建立的易感-耐受兴奋性神经元亚型对，发现易感神经元相对于其耐受对应物表现出更高的Gpc5和更低的Sort1表达。人类单细胞转录组图谱分析进一步证实EC中保守的GPC5-高和SORT1-低表达模式。

4.3.2 正常衰老过程中小鼠易感神经元中Gpc5和Sort1的表达

衰老时间序列分析显示，EC第II层Reln+神经元在5至12月龄期间Gpc5和Sort1表达降低，随后在24月龄时表达增加，这种降低-恢复动态是EC第II层Reln+神经元特有的。

4.3.3 人类AD Braak分期中RELN+ EC第II层神经元的GPC5和SORT1表达

在认知正常对照中，EC第II层RELN+GPC5+兴奋性神经元表现出所有EC神经元群体中最高的GPC5和最低的SORT1表达。在AD早期进展（Braak I–IV期）中，EC第II层RELN+GPC5+神经元显示GPC5表达增加和SORT1表达降低，这种模式在EC内其他易感神经元群体中未观察到。

4.3.4 小鼠脑内EC第II层神经元中Gpc5和Sort1的表达

在EC第II层神经元中，Sort1水平在ENTl和ENTm之间相当，而Gpc5在L2 ENTm中的表达高于L2 ENTl。

4.3.5 一个包含Sort1的模块区分EC第II层内的外侧与内侧群体

WGCNA分析鉴定出一个52基因共表达模块，在ENTl神经元中特异性富集，包含Sort1。该模块在独立参考数据集中可稳健地将L2 ENTl神经元与L2 ENTm和L3 ENT神经元分开。

4.3.6 包含Sort1的模块富集蛋白质稳态相关过程

功能富集分析显示该52基因模块显著富集与蛋白质稳态相关的分子功能，包括泛素特异性蛋白酶结合、核糖核蛋白和核糖体相关功能以及转录调控。i-cisTarget分析鉴定出94个显著富集的顺式调控特征，包括14个转录因子结合位点和28个组蛋白修饰相关区域。

五、讨论与结论

选择性神经元易感性是AD的标志性特征，但不同神经元群体选择性易感的内在分子特征仍不完全清楚。本研究发现PIR中Reln+ PN在AD模型中与Aβ病理存在空间关联，鉴定出PIR与EC第II层易感神经元共享的Gpc5-高/Sort1-低分子特征，并发现一个区分LEC与MEC第II层神经元且富集蛋白质稳态相关过程的Sort1相关共表达程序。蛋白质稳态改变（包括蛋白质折叠、细胞内运输和降解通路）已成为与神经元易感性相关的候选特征。SORT1作为AD相关风险基因，编码参与细胞内运输和蛋白质稳态相关通路的分选受体。LEC第II层神经元中鉴定的SORT1相关基因模块富集蛋白质稳态相关过程，且LEC在AD进展中比MEC更早更严重退化，这些发现与蛋白质稳态相关程序差异可能与AD中选择性神经元易感性相关的假说一致。

在人类AD风险分析中，尽管GPC5和SORT1的常见遗传变异与AD风险关联有限，但两个基因均表现出显著的多组学风险信号，提示其疾病易感性贡献可能更与调控性分子改变相关。

研究局限性包括：组学分析鉴定的是关联而非因果关系；空间转录组分析在Aβ沉积驱动的小鼠模型中进行，可能无法完全捕捉人类AD进展的复杂性；研究定义了易感性的分子相关性，但未直接评估其对嗅觉回路功能的影响。尽管如此，Gpc5/Sort1相关易感性特征在小鼠和人类单细胞转录组数据集中的保守性支持了这些分子特征与人类AD易感性的相关性。