通过无皂乳液聚合制备共价键合供体-受体微球用于高性能光引发化学发光检测C反应蛋白

《Polymer》：Covalently Bonded Donor and Acceptor Microspheres via Soap-Free Emulsion Polymerization for High-Performance Light-Initiated Chemiluminescent Assay Detection of C-Reactive Protein

　　C-反应蛋白（CRP）是诊断和治疗监测炎症及心血管疾病的重要生物标志物。尽管光启动化学发光检测技术（LICA）能够实现快速、高灵敏度的均相检测，但其广泛应用受到供体微球和受体微球严格要求性能的限制。本研究通过无皂乳液共聚策略，将2-乙烯基噻吩、铕配合物和光敏剂引入聚苯乙烯基体中，成功制备了共价连接的供体和受体微球。随后，向基体中引入氧化葡聚糖表面修饰，以增强生物相容性和生物分子偶联效率。所得微球表现出优异的均一性、高光学稳定性和良好的表面特性，适用于均相免疫检测。所开发的基于LICA的CRP检测试剂展现了令人满意的分析性能，高浓度样本的相对偏差范围为-1.0%至0.7%，低浓度样本的相对偏差范围为-1.0%至0.6%。批内精密度显示变异系数范围为4.20%至4.70%，批间相对偏差范围为4.45%至6.46%，均满足预设的<8%的接受标准。与常规免疫检测技术相比，所开发检测试剂的平均偏差为-1.47 ng/mL，90%的测量值落在一致性范围内（-6.15至4.18 ng/mL），表明两种检测方法之间具有良好的一致性。所开发的微球为均相LICA提供了可靠的材料平台，并在CRP检测的临床应用中展现出巨大的潜力。C-反应蛋白（CRP）是一种参与天然免疫反应的关键急性期蛋白[1]、[2]。在炎症过程中，血清CRP水平可大幅升高，因此CRP是评估炎症状态和监测心血管疾病（包括动脉粥样硬化和冠心病）进展的可靠生物标志物。因此，高灵敏度和高精度的CRP检测技术在体外诊断领域受到了广泛关注。目前临床常用的CRP检测方法包括酶联免疫吸附测定[3]、[4]、磁分离化学发光检测[5]、[6]、[7]、胶体金免疫层析检测[8]、[9]、电化学传感方法[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]以及常规免疫检测技术（IT）^[16]。这些方法大多依赖于异相检测格式，难以同时实现高灵敏度、宽动态范围和快速分析性能。尽管IT采用了均相检测格式，但其有限的灵敏度和不足抗干扰能力限制了其在高灵敏度CRP精确定量中的应用。相比之下，光启动化学发光检测技术（LICA）凭借均相特性、免洗涤格式^[17]、高灵敏度、宽动态范围和优异特异性[18]、[19]、[20]，已成为一种用于CRP检测的有前途的平台。然而，LICA的更广泛临床应用仍受到其核心试剂——供体微球和受体微球[21]、[22]、[23]性能有限的制约，这对试剂开发和大规模商业化提出了重大挑战。因此，制备高性能的供体和受体微球对于建立可靠的CRP均相LICA检测平台至关重要。作为LICA的关键功能组分，供体微球和受体微球提供了高通量、简化操作和快速分析响应。为满足均相免疫检测的严格要求，这些微球需要具备优异的均一性、高光学稳定性、良好的生物相容性和高效的表面功能化能力[24]、[25]。目前供体和受体微球的制备策略大致可分为两类：物理修饰和化学共聚。包括物理吸附、表面包覆和自组装在内的传统方法易于实施；然而，它们存在一些固有的局限性。荧光染料、噻吩衍生物和光敏剂等功能组分通常通过非共价相互作用引入微球中，导致在储存或使用过程中可能发生泄漏和脱落。当应用于LICA基均相、免洗涤免疫检测时，这些缺陷可能导致背景噪声增加和信号不稳定，显著影响其定量检测准确性[26]、[27]。与物理修饰方法相比，化学共聚具有显著优势。在该策略中，含有可聚合基团的荧光功能单体、噻吩衍生物和光敏剂分子被直接引入聚合过程，实现功能组分在聚合物基体中的共价连接。这种共价固定化有效减少了功能分子的泄漏，同时确保活性基团在微球中均匀分布。因此，可显著提高微球的光学稳定性、结构完整性和批间重现性，使化学共聚成为开发用于高灵敏度LICA基均相免疫检测的供体和受体微球的一种有前途的策略[28]、[29]、[30]、[31]。在各种聚合物材料中，聚苯乙烯（PS）因其优异的刚性、光学透明性、表面可修饰性和理化稳定性而被广泛认为是构建高性能供体和受体微球的一种有前途的基体材料[32]、[33]、[34]、[35]、[36]、[37]。因此，基于PS的微球已在生物分析和诊断领域得到广泛应用[38]、[39]、[40]、[41]、[42]、[43]、[44]。先前的研究表明，将稀土配合物引入PS微球可显著提高其光致发光性能和热稳定性，从而增强其在高灵敏度均相检测系统中的适用性[45]、[46]、[47]。基于PS的供体和受体微球主要通过溶液聚合或常规乳液聚合制备[48]、[49]、[50]、[51]、[52]、[53]、[54]。然而，这些方法存在一些固有的局限性，因为在合成过程中引入的残余有机溶剂和乳化剂可能引入杂质。为解决这一问题，无皂乳液聚合免去了有机溶剂和表面活性剂的使用，从而能够制备出表面洁净、均一性优异且表面特性良好的PS微球[55]、[56]。本研究通过无皂乳液共聚策略，开发了用于均相体外诊断应用的高性能供体和受体微球。将稀土发光单体Eu(AA)₃Phen作为发光中心引入，同时将2-乙烯基噻吩和光敏剂FUS-ZnSiPc引入苯乙烯基体中，构建高效的光学功能微球。系统研究了功能组分含量和粒径匹配对微球形貌和发光性能的影响。此外，采用氧化葡聚糖修饰来增强微球的亲水性、生物相容性和生物分子偶联效率[57]、[58]、[59]、[60]、[61]。所开发的供体和受体微球表现出优异的灵敏度和稳定性，为构建基于LICA的CRP检测平台提供了坚实的材料基础。苯乙烯（St）、过硫酸钾（KPS）、2-乙烯基噻吩（2-VT）和链霉亲和素（SA）购自上海麦克林生化科技有限公司（中国上海）。EuCl₃、丙烯酸（AA）、1,10-菲啰啉（Phen）、3-(甲基丙烯酰氧基)丙基三甲氧基硅烷（MPS）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）、葡聚糖（Dex）、酞菁锌（ZnPc）、NaIO₄、三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris）、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺图2A展示了FUS-ZnSiPc的合成路线，图2B展示了所得产物的傅里叶变换红外光谱（FT-IR）图谱。1610.9 cm^-1处的吸收带归属于共轭C=C键的伸缩振动。1484.3和1406.5 cm^-1处的吸收带归属于酞菁芳香环的特征骨架振动。1333.3和1283.0 cm^-1处的吸收带分别归属于C–N和C–O键的伸缩振动。总之，通过无皂乳液共聚策略，成功制备了共价连接功能组分的高性能供体和受体微球，为基于LICA的均相免疫检测提供了可靠的材料平台。主要研究结果总结如下：(1) 在无表面活性剂条件下，Eu(AA)₃Phen、2-乙烯基噻吩（2-VT）和光敏剂FUS-ZnSiPc等功能基团被共价连接引入聚苯乙烯基体中数据可根据需要提供。本研究由中国先进光学聚合物与制造技术国家重点实验室资助（26QZZSKTYB01）。赵瑾：撰写——审阅与编辑、资金获取。文明达：监督指导。尹艳南：调查研究。任小兵：监督指导。高旭：验证。王明辉：调查研究。林雪：撰写——初稿、正式分析、概念构思。宋晓：监督指导作者声明不存在利益冲突。? 作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。林雪|宋晓|尹艳南|任小兵|高旭|王明辉|赵瑾|文明达青岛科技大学高分子科学与工程学院，中国 青岛 266042