熊果苷通过激活苯丙烷代谢途径并增强鲜核桃的抗氧化能力来抑制霉变并保持品质

《Postharvest Biology and Technology》：Arbutin suppresses mildew and maintains quality by activating phenylpropanoid metabolism and enhancing antioxidant capacity of fresh walnuts

　　

•熊果苷熏蒸抑制了鲜核桃的壳霉变。
•熊果苷激活了苯丙烷代谢以促进酚类积累。
•熊果苷增强了抗氧化能力以减少脂质氧化。
•熊果苷保持了风味和油脂品质。
•熊果苷维持了果仁品质并延长了冷藏寿命。

**1. 引言**

核桃是世界上四大最受欢迎坚果之一。中国是世界最大的核桃生产国。根据美国农业部数据，2024–2025产季中国干核桃商业产量约为150万吨（https://apps.fas.usda.gov）。目前，鲜核桃因其酥脆的口感和丰富的营养而日益受到消费者青睐，这与公众日益增长的保健意识相契合。与干核桃相比，鲜核桃含有更高水平的酚类物质、多不饱和脂肪酸、蛋白质、维生素E和抗氧化能力。然而，由于其较高的水分含量、不饱和脂肪酸和酶活性，鲜核桃在储存过程中极易发生不良变化，如失水、霉变和油脂酸败，导致重大经济损失。此外，果仁外膜颜色也容易随着储存时间的延长而变深，这对其感官品质产生不利影响。

低温在维持鲜核桃采后品质方面起着重要作用，但仅在0°C下储存无法有效控制霉变生长并保持鲜核桃品质，霉变通常会在储存30天后出现在壳表面。一些已报道的技术，如气调包装、二氧化氯结合控温气调、核桃青皮提取物和辐照等，在保持鲜核桃品质方面显示出一定的积极效果。然而，气调包装对霉变和品质的影响仍然有限。化学防腐剂二氧化氯可能对人类健康有害，并且由于其在水中的积累对潜在环境造成威胁，而辐照技术由于其高成本和操作复杂性，其应用仍然受限。因此，探索一种具有强大协同适用性的新型防腐剂对于延长鲜核桃储存期并保持稳定的市场供应至关重要且紧迫。

熊果苷是一种对苯二酚葡萄糖苷衍生物，具有抗氧化、抗炎和抗菌等多种药理学特性，目前广泛用于化妆品和草药膳食补充剂。作为一种天然化合物，它存在于许多可食用植物中，如梨和小麦，核桃中也有分布。熊果苷是酪氨酸酶的抑制剂，可直接抑制TYR活性以及左旋多巴和多巴醌的合成，从而抑制黑色素产生。然而，迄今为止，尚无关于熊果苷作为防腐剂在果实采后保鲜领域应用的相关报道。

霉变生长、果仁外膜褐变、果仁抗氧化能力、油脂品质和营养品质是评价鲜核桃采后品质的重要方面。鲜核桃果仁富含粗脂肪和不饱和脂肪酸，酸值反映游离脂肪酸水平，过氧化值表征多不饱和脂肪酸的氧化程度。抗氧化能力可通过三价铁还原抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除活性和丙二醛含量来评价。苯丙烷途径是植物酚类和黄酮类化合物生物合成的重要途径，这些化合物的积累可能源于非生物胁迫，在增强植物胁迫耐受性方面起着至关重要的作用。苯丙氨酸解氨酶催化苯丙烷途径的第一个承诺步骤，催化苯丙氨酸的非氧化性L-脱氨反应并产生反式肉桂酸，随后肉桂酸在肉桂酸-4-羟化酶的作用下转化为4-香豆酸。此后，4-香豆酸在4-香豆酸-CoA连接酶的作用下转化为4-香豆酰-CoA，进而进行酚类和黄酮类化合物的合成。4-香豆酸也可以通过酪氨酸解氨酶从L-酪氨酸产生，而酪氨酸既是酪氨酸酶的底物也是酪氨酸解氨酶的底物。然而，植物酪氨酸代谢途径及相关途径酶编码基因尚未完全界定。在本研究中，苯丙烷途径被认为与PAL活性相关。此外，多酚氧化酶和过氧化物酶可催化酚类化合物的氧化。因此，研究熊果苷处理对上述指标的影响对于评估其在储存期间对鲜核桃的保鲜效果具有重要意义。本研究旨在探索100 mg L?1熊果苷处理对0±1°C储存期间鲜核桃霉变、苯丙烷途径、抗氧化能力和品质相关指标的影响，这将为熊果苷在鲜核桃及其他易霉变坚果储存中的应用提供理论基础。

**2. 材料与方法**

**2.1 实验材料和处理**

在中国陕西省陇县，于自然成熟期手工采收"青香"核桃果实。核桃被认为已准备好采收的状态为硬壳期，此时青皮出现裂纹但仍粘附在壳上，并观察到果仁半块之间及周围的包裹组织发生褐变，作为果仁成熟的物候指标。采收时，从10株生长旺盛的树上等量收集核桃果实。手工去除青皮，核桃迅速用流水冲洗。在环境条件下避光表面干燥15小时后，选择无机械损伤和病害的核桃，彻底混合后用于后续处理。

鲜核桃随机分为对照组和处理组。处理组用100 mg L?1熊果苷溶液进行雾化处理，浓度基于初步预试验结果，而对照组用蒸馏水进行熏蒸。样品在25°C、75%相对湿度下的恒温湿度雾化工室内雾化30分钟，配备外部雾化器。雾化器以5 μm液滴直径和10 mL min?1雾化速率运行。为确保雾化均匀性，鲜核桃单层放置，并使用小型循环风扇促进雾化液滴充分分散。雾化后，风扇继续运行30分钟。一旦坚果表面完全干燥，立即分入通风塑料篮中，装入0.04 mm厚聚乙烯袋中，然后在0±1°C、75%-85%相对湿度的步入式冷库中储存。对照组和处理组各设3个重复，每个重复14袋，每袋10个核桃。

**2.2 实验采样**

在储存过程中，每隔7天从对照组和处理组中取出鲜核桃，当处理组霉变发生率达到20%时实验终止。每次采样时，从每个处理的三个重复中各取三个篮子。拍照外观后，评价壳霉变、外膜褐变和颜色。随后，手工获取外膜完整的果仁，立即在液氮条件下冷冻并研磨成细粉。粉末样品在-80°C储存用于后续指标测定。

**2.3 指标测定**

**2.3.1 外观、霉变和褐变**

使用数码相机拍摄鲜核桃和果仁的外观照片。霉变发生率根据Ma等人描述的标准定义，鲜核桃壳表面出现可见菌丝被认为发生霉变，以每包装袋中霉变核桃占总核桃数的百分比表示。褐变发生率根据Sun等人描述的方法测定。

根据Intarasit等人描述的方法，对核桃外膜的褐变发生率和受影响面积进行目视评价。褐变指数基于0–5级颜色评级尺度测量，计算方式为将每个褐变等级中果实百分比乘以对应褐变等级的乘积之和，计算公式如下：褐变指数 = Σ（褐变等级 × 各等级果实百分比）。同样，根据Thavong等人的描述，霉变指数基于0–5级颜色评级尺度测量，计算公式如下：霉变指数 = Σ（霉变等级 × 各等级果实百分比）。

**2.3.2 颜色**

在每次采样时，使用色差仪从每个处理的每个重复中测量坚果果仁外膜的颜色。参数包括亮度、红绿度和黄蓝度。每个坚果上设置三个相对固定的测量点。总色差根据以下公式计算：ΔE* = [ΔL*2 + Δa*2 + Δb*2]^1/2。ΔL*、Δa*、Δb*和ΔE*的值分别表示L*、a*、b*与初始值之间的差异。

**2.3.3 脆度**

在每次采样时，使用质构分析仪测定每个处理每个重复样品的脆度。将半片带外膜的果仁放在测试平台上。使用P/50探头，参数如下：触发力0.1 N，预测试速度1 mm s?1，测试和测试后速度2 mm s?1，两个压缩周期间暂停10 s，测试距离30 mm。脆度由样品初始探头压缩期间力-变形曲线上的第一个显著压力峰表示。数值越小表示脆度越好。

**2.3.4 挥发性有机化合物**

按照Xi等人描述的方法进行轻微修改，使用Flavor Spec?风味分析仪分析鲜核桃的挥发性有机化合物。使用FS-SE-54-CB毛细管柱，柱温为60°C。将1 g果仁粉放入顶空瓶中，在70°C下以500 × g震荡孵育10 min。随后，使用85°C的注射器自动注入500 μL顶空，以氮气作为载气。柱温保持在60°C。载气流速在0至2 min设置为2 mL·min?1，从2至20 min线性增加至100 mL·min?1。使用C4-C8正酮作为外部参考物，计算每种挥发性化合物的保留指数。通过使用GC×IMS Library Search软件比较保留指数和漂移时间来识别挥发性有机化合物。

**2.3.5 关键酶活性和基因表达分析**

PAL、C4H、4-CL、POD和PPO的活性根据商业试剂盒的说明测定，以每克新鲜样品为单位表示。将0.1 g冷冻核桃果仁粉与1 mL相应的提取缓冲液混合，在4°C下以10,000 × g离心10 min。收集上清液，所有后续步骤严格按照试剂盒说明进行。PAL活性根据PAL催化L-苯丙氨酸转化为反式肉桂酸和氨的原理测定，其中1个单位定义为每分钟引起0.1个吸光度单位变化的量。C4H活性根据C4H催化肉桂酸转化为4-羟基肉桂酸的原理测定，其中1个单位定义为每分钟消耗1 nmol NADPH的量。4-CL活性根据4-CL催化4-香豆酸和CoA转化为4-香豆酰-CoA的原理测定，其中1个单位定义为每小时产生1 nmol 4-香豆酰-CoA的量。

POD活性测定基于POD催化H?O?氧化特定底物的原理，PPO活性测定基于PPO催化儿茶酚氧化为邻苯醌的原理，其中1个单位（U）定义为每分钟使吸光度改变0.01的酶量。TYR活性测定采用商品化试剂盒（BOXBIO，北京，中国），按说明书操作，将0.1 g核桃仁粉与1 mL提取缓冲液混合，于4 °C、12,000 × g下离心20 min，收集上清液，后续步骤按试剂盒说明进行。TYR活性测定基于TYR催化L-DOPA转化为多巴醌的原理，其中1个单位（U）定义为每分钟产生1 nmol多巴醌的酶量。新鲜核桃仁的总RNA提取和逆转录按照Liu等人（2021）报道的方法进行。将200 mg冷冻核桃仁粉与1 mL预热的提取缓冲液[2% (w/v) CTAB、4 mol L?1 NaCl、50 mmol L?1 EDTA、2% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮、4% (v/v) β-巯基乙醇]混合，剧烈涡旋2 min，于65 °C温育10 min。收集上层相转移至新管中，加入等体积水饱和酚/氯仿（2:1），于4 °C、12,000 × g下离心5 min。重复上述步骤后，向上层相中加入1 mL氯仿，充分混匀，于12,000 × g下离心。收集上清液，加入等体积4 mol L?1氯化锂、等体积乙醇和20 mL 3 mol L?1醋酸钠。混合物于0 °C沉淀10 min，于4 °C、12,000 × g下离心10 min。沉淀溶于200 μL DEPC处理的水中，依次用等体积水饱和酚/氯仿（1:1）和氯仿萃取两次。回收上清液，加入3倍体积乙醇，于0 °C离心15 min，于4 °C、12,000 × g下离心10 min。沉淀风干除去乙醇，溶于30 μL DEPC处理的水中。总RNA使用Bioanalyzer（2100 Bioanalyzer，Agilent Technologies，美国）定量，其完整性通过在1.5%琼脂糖凝胶上电泳并用溴化乙锭染色验证。根据我们的转录组数据，通过KEGG富集分析筛选与苯丙烷代谢途径酶显著相关的基因，并利用BLAST在NCBI数据库（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中获取其编码序列。使用Primer Premier 5.0软件（Premier，加拿大）设计的特异性引物列于补充表S1中。在QuantStudio 5（Thermo Fisher Scientific，美国）上进行实时定量PCR，以18S rRNA作为内参基因。热循环条件如下：初始变性95 °C 30 s，随后40个循环，每个循环包括95 °C变性10 s和60 °C退火/延伸30 s。相对基因表达水平采用2?ΔΔCt法计算，结果以三次重复试验的均值表示。

2.3.6 总酚和总黄酮含量
总酚含量的测定参考Zhang等人（2020）报道的方法并略作修改。将0.5 g冷冻核桃仁用10 mL 70% (v/v)乙醇提取，于4 °C、10,000 × g下离心10 min。取1 mL上清液与4 mL 10% (v/v) Folin-Ciocalteu试剂和3.6 mL 7.5% (w/v) Na?CO?溶液混合。于70 °C温育10 min后，使用分光光度计在765 nm处测定吸光度。以没食子酸为标准品制备标准曲线，总酚含量以每克样本的没食子酸毫克当量表示（mg g?1）。

总黄酮含量的测定参考Park和Lee（2021）的方法并略作修改。取1 mL上述上清液与0.2 mL 5% (w/v) NaNO?溶液混合。静置6 min后，加入0.2 mL 10% (w/v) Al(NO?)?溶液。再静置6 min后，加入2 mL 4% (w/v) NaOH溶液。混合物在室温下温育15 min，使用分光光度计在510 nm处测定吸光度。以芦丁为标准品制备标准曲线，总黄酮含量以每克样本的芦丁毫克当量表示（mg g?1）。

2.3.7 抗氧化能力
新鲜核桃的抗氧化能力通过FRAP、DPPH自由基清除活性和ABTS•+自由基清除活性进行评估。FRAP按商品化试剂盒（Solarbio，北京，中国）说明书测定。将0.1 g冷冻核桃仁粉与1 mL提取缓冲液混合，于4 °C、10,000 × g下离心10 min，收集上清液，后续所有步骤按试剂盒说明进行。测定原理为：在酸性条件下，待测物将Fe3?-联吡啶三唑还原为蓝色的Fe2?-联吡啶三唑。将0.5 g核桃粉用10 mL 50% (v/v)乙醇提取，于4 °C、10,000 × g下离心10 min，收集上清液。DPPH自由基清除活性采用Zhang等人（2025a）报道的方法测定。将上述提取物与0.2 mmol L?1 DPPH溶液混合，避光温育30 min，在517 nm处测定吸光度。ABTS•+自由基清除活性按Qin等人（2024）报道的方法测定。将ABTS•+溶液（7 mmol L?1）与等体积4 mmol L?1过硫酸钾溶液混合，所得ABTS•+溶液用甲醇稀释至吸光度为0.70 ± 0.02。取0.6 mL上述提取物与2.4 mL ABTS•+溶液混合，避光温育30 min，在734 nm处测定吸光度。DPPH和ABTS•+自由基清除活性采用以下公式计算：E(%) = [1 - (A? - A?)/A?] × 100。其中E表示自由基清除活性，A?为DPPH溶液的吸光度，A?为含有DPPH和上清液的反应混合物的吸光度，A?为上清液的吸光度。

2.3.8 脂肪含量、酸价、过氧化值和MDA含量
脂肪含量采用索氏提取法测定。每个处理每个重复取10 g样品，使用石油醚（沸点范围30–60 °C）在索氏提取器（NAI-ZFCDY-6Z，上海那艾公司，中国）中提取12 h。油含量以鲜重为基础表示，提取的油用于后续酸价和过氧化值测定。酸价（AV）和过氧化值（PV）分别按中国国家标准GB/T 5009.229–2016和GB/T 5009.227–2016测定。酸价测定时，取0.5 g油用0.01 mol L?1 NaOH标准溶液滴定，结果以每千克样品的NaOH毫摩尔数表示。过氧化值测定时，取1.5 g油用0.002 mol L?1硫代硫酸钠标准溶液滴定，过氧化值以每千克样品的活性氧毫摩尔数表示。MDA含量采用TBA法测定（Wang等人，2004）。取0.5 g样品与5 mL 7.5% (w/v)三氯乙酸溶液提取，于10,000 × g下离心10 min，收集上清液。取1.0 mL上清液与1 mL 0.02 mol L?1硫代巴比妥酸溶液混合，于90 °C加热30 min，冷却至室温，在532 nm处测定吸光度。以丙二醛腙标准品制备标准曲线。

2.3.9 可溶性糖、可溶性蛋白和内源性熊果苷含量
可溶性糖含量按商品化试剂盒（Solarbio，北京，中国）说明书测定。将0.1 g冷冻核桃仁粉与1 mL蒸馏水混合，沸水浴加热10 min，于室温下8000 × g离心10 min。收集上清液，后续步骤按试剂盒说明进行，测定原理为蒽酮比色法。

可溶性蛋白含量采用Bradford法测定。取0.5 g样品与10 mL蒸馏水提取，于4 °C、10,000 × g下离心20 min，收集上清液。将0.1 g考马斯亮蓝G-250溶于50 mL 90%乙醇溶液中，与100 mL 85%磷酸混合，用蒸馏水定容至1000 mL。取1 mL上清液与5 mL考马斯亮蓝G-250溶液混合，静置2 min，使用紫外-可见分光光度计在595 nm处测定吸光度。以牛血清白蛋白为标准品制备标准曲线。

内源性熊果苷含量按Cui等人（2022）的方法测定并略作修改。简要步骤如下：取0.5 g冷冻样品溶于30 mL甲醇（MeOH）中，加入1.25 mL 2 M H?SO?，用甲醇定容至50 mL。超声处理5 min后，通过0.45 μm膜过滤器过滤。HPLC（Agilent Waters 1200，美国加利福尼亚州）配备反相C18色谱柱（Ultimate?，5.0 μm，4.6 mm × 250 mm），检测波长和柱温分别为280 nm和30 °C。流动相由甲醇、乙腈（ACN）和水组成，梯度洗脱程序如下：0–7 min为10%水和90%甲醇，7.1–17 min为40%水、40% ACN和20%甲醇，17.1–20 min为90%水和10%甲醇。进样量为10 μL，流速设为0.8 mL min?1。以熊果苷标准品（麦克林，上海，中国）进行定量，结果以μg g?1表示。

2.4 统计分析
所有实验均设三个生物学重复并随机排列，结果以均值 ± 标准差（SD）表示。使用IBM SPSS Statistics 27软件进行Duncan检验评估对照组与处理组之间的差异，差异在p < 0.05水平被认为显著，并以不同字母标记。主成分分析（PCA）和Pearson相关性分析使用Origin 2022b进行。所有图形均使用Origin 2022b绘制。本研究中的所有指标均以鲜重为基础表示。

3 结果

3.1 外观、霉变和褐变
鲜核桃壳的霉变发生率随储存时间逐渐增加。对照组在储存7 d后出现霉变，而熊果苷处理组将霉变初始发生时间延迟至28 d。至70 d时，对照组和处理组的霉变发生率分别为46.67%和20%，处理组低于对照组（图1B）。在35、63和70 d时，处理组的霉变发生率均低于对照组（图1C），表明熊果苷处理能有效抑制鲜核桃壳的霉变生长。

褐变的发生率和褐变指数在储存过程中逐渐增加。对照组和处理组分别在7 d和14 d后出现褐变。在28 d和63 d时，处理组的褐变发生率低于对照组（图1D），表明熊果苷在抑制鲜核桃壳霉变的同时，也在一定程度上延迟了核桃仁外皮褐变的发生。

3.2 色泽
在整个储存期间，鲜核桃外皮的ΔE和a*值持续增加，而L*和b*值逐渐降低。与对照组相比，除7 d外，熊果苷处理组在整个储存期间的L*值更高，ΔE值更低（图1F、G、H、I）。这些结果表明熊果苷处理能有效维持鲜核桃外皮的色泽。

3.3 脆度
储存过程中，鲜核桃的脆度逐渐下降，在35 d储存期间下降速度较快。在此期间，处理组的脆度高于对照组，而49至70 d两组间无显著差异（图1J）。

3.4

# 挥发性有机物（VOCs）组成与含量

在对照和熊果苷处理组的鲜核桃中，于0、35和63 d贮藏期间共检测到55种VOCs，主要分为九大类，包括酯类（15种化合物）、酮类（13种）、醛类（12种）、醇类（5种）和含氮化合物（5种）（图2A）。在二维VOCs图谱中，纵轴表示气相色谱保留时间，横轴表示离子相对漂移时间，强度信息以颜色差异表示。该图谱提供了全面的可视化呈现，准确展示了香气化合物的种类与强度信息。大多数VOCs分布在0–12 ms的漂移时间范围内（图2B）。九类化合物的热图显示，从初始阶段到63 d贮藏期，与氧化酸败密切相关的醛类在对照组的相对含量高于处理组。鲜核桃中酮类的相对含量随贮藏时间逐渐增加，0 d样品及35 d熊果苷处理组的酮类含量低于其他样品。35和63 d时，处理组中含氮化合物的相对含量低于对照组（p < 0.05）。然而，63 d时处理组中含硫化合物的含量高于其他组（p < 0.05）。与0 d样品相比，赋予果香和酒香的酯类在贮藏期间处理组和对照组均逐渐降解。就VOCs总量而言，处理组的相对含量显著低于对照组（p < 0.05）（图2C）。这些结果共同表明，在相同贮藏时间点，处理组样品表现出更好的风味稳定性。贮藏时间是驱动鲜核桃风味品质演变的关键因素，而熊果苷处理通过有效抑制脂质氧化，对鲜核桃的风味表现出保护作用。

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**图2.** 鲜核桃贮藏期间挥发性有机化合物（VOCs）、其二维图谱比较（B）及九大类热图（C）。基于GC-IMS的VOCs指纹图谱（A）。在图2A中，每个色块的颜色代表样品中相应化合物的相对丰度。红色和蓝色分别代表高丰度和低丰度，从红色到蓝色的变化对应丰度的逐渐降低。在图2B中，每个彩色斑点代表一种挥发性化合物；斑点的颜色强度对应于该化合物的信号强度（浓度水平）；红色代表信号强度高、化合物浓度高，蓝色代表信号强度弱、化合物浓度低。在图2C中，每个色块的颜色代表数据标准化后各类化合物的丰度。红色和蓝色分别表示该类化合物的丰度高于和低于所有样本的总体平均水平。

## 3.5 关键酶活性与基因表达水平

贮藏期间，对照和熊果苷处理组鲜核桃的PAL活性均呈先升后降的趋势。在14–42、56和70 d时，处理组的PAL活性高于对照组。该处理使峰值活性从对照组的289.20 U g?1提高至292.95 U g?1，并将峰值时间从49 d提前至42 d（图3A）。对照组和熊果苷处理组的C4H活性表现出与PAL相似的趋势。在35 d及56–63 d贮藏期间，处理组的C4H活性高于对照组。56–63 d贮藏期间，处理组和对照组的平均C4H活性分别为492.14和385.86 U g?1（图3B）。就4-CL活性而言，在21–49和70 d贮藏期间，处理组的4-CL活性高于对照组。21–49 d期间，处理组和对照组的平均4-CL活性分别为396.20和336.83 U g?1（图3C）。

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**图3.** 熊果苷处理对鲜核桃贮藏期间PAL、C4H、4-CL、POD、PPO和TYR活性及苯丙烷代谢相关基因表达水平的影响。

对照和熊果苷处理组鲜核桃的POD活性在贮藏期间均呈现双峰模式。35–49 d贮藏期间，处理组的POD活性低于对照组，后者为前者的1.43–1.85倍。其他时间点和两组之间无显著差异（图3D）。就PPO活性而言，在21–42和63 d贮藏期间，对照组的活性高于处理组。21–42 d期间，对照组和处理组的平均PPO活性分别为33.70和21.90 U g?1（图3E）。就TYR活性而言，除14 d贮藏时处理组活性较高以及7、56和63 d时两组间无显著差异外，处理组的TYR活性在所有其他时间点均低于对照组（图3F）。

本研究采用qRT-PCR检测了9个与苯丙烷代谢密切相关的基因的相对表达水平（图3）。贮藏期间，熊果苷处理显著上调了PAL家族同源基因JrPAL（118349731）、JrPAL（109017562）和JrPAL（109009407）的表达水平，并在21–42 d观察到显著的表达峰值。处理组的峰值强度和持续时间均高于对照组。具体而言，处理组中JrPAL（118349731）在14和42 d达到表达峰值，分别为对照组的11.4倍和2.1倍（图3G、H、I）。这些结果表明，熊果苷能够激活启动苯丙烷代谢的关键酶基因并增强代谢前体的合成通量。对于4-CL同源基因Jr4-CL2（108998879）和Jr4-CL6（109008312），熊果苷处理也显著增强了其表达水平。Jr4-CL2（108998879）在对照组和处理组中均在14 d贮藏时出现第一个显著表达峰值，前者峰值水平为后者的1.9倍。熊果苷处理将Jr4-CL6（108998879）的表达激活提前至21 d，其表达峰值出现在42 d，为对照组的2.6倍（图3J、K）。此外，熊果苷处理在一定程度上下调了JrPOD31（108992831）、JrPOD63（108997072）和JrPOD72（108995760）的相对表达水平，而上调了JrLAPOD（109006470）的相对表达水平。70 d贮藏时，处理组中JrLAPOD的表达水平为对照组的9.2倍（图3L、M、N、O）。

## 3.6 总酚和总黄酮含量及抗氧化能力

对照和熊果苷处理组的总酚含量在整个贮藏期间均呈下降趋势。在整个贮藏期间，处理组的总酚含量高于对照组，处理组和对照组的平均值分别为9.36和7.42 mg g?1（图4A）。对照组和处理组之间总黄酮含量的差异与总酚含量的差异类似。除21和49 d无显著差异外，处理组的总黄酮含量在所有其他时间点均高于对照组（图4B）。这些结果表明，熊果苷处理有效抑制了鲜核桃在冷贮藏期间总酚和总黄酮含量的下降。

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**图4.** 熊果苷处理对鲜核桃贮藏期间总酚、总黄酮含量、FRAP、DPPH自由基清除活性、ABTS•+自由基清除能力、含油量、酸价（AV）、过氧化值（PV）及MDA含量的影响。

对照和熊果苷处理组鲜核桃的FRAP值一般随贮藏时间的延长而增加。除7和35 d外，处理组的FRAP值均高于对照组。35 d贮藏后，处理组和对照组的平均FRAP值分别为16.54和12.15 mmol g?1（图4C）。就DPPH自由基清除活性而言，28、42和63 d贮藏时，处理组的值高于对照组（图4D）。就ABTS•+自由基清除活性而言，除7和63 d无显著差异外，贮藏期间处理组的值在所有其他时间点均高于对照组（图4E）。

## 3.7 酸价（AV）、过氧化值（PV）和MDA含量

鲜核桃的AV和PV值在贮藏期间呈上升趋势。35 d贮藏后，熊果苷处理组的AV值显著低于对照组（p < 0.05），处理组和对照组的平均AV值分别为0.25和0.30 mg g?1（图4F）。21 d以及35–63 d期间，处理组的PV值低于对照组（图4G）。MDA含量是反映植物细胞膜脂质过氧化程度的重要指标。在整个贮藏期间，对照组和处理组鲜核桃的MDA含量呈增加趋势。除贮藏初期7 d和末期70 d两组间无显著差异外，处理组的MDA含量在所有其他时间点均显著低于对照组（p < 0.05）。此外，处理组的MDA含量在56 d贮藏后迅速增加（图4H）。

## 3.8 脂肪、可溶性糖、可溶性蛋白和内源性熊果苷含量

贮藏期间，除42 d时处理组的脂肪含量高于对照组外，熊果苷处理组与对照组在所有时间点的脂肪含量均无显著差异（图5A）。对照和处理组鲜核桃的可溶性糖含量整体呈先升后降的趋势。35–42 d贮藏期间，对照组和处理组的平均可溶性糖含量分别为54.50和33.93 mg g?1，处理组的含量显著低于对照组（p < 0.01）（图5B）。对照和处理组的可溶性蛋白含量在前21 d贮藏期间几乎无变化。然而，在28–63 d期间，处理组的可溶性蛋白含量明显低于对照组（p < 0.05）（图5C）。这些结果表明，熊果苷处理有效减缓了鲜核桃在贮藏期间可溶性糖和可溶性蛋白含量的增加。

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**图5.** 熊果苷处理对鲜核桃贮藏期间可溶性蛋白、可溶性糖和内源性熊果苷含量的影响。

对照组和处理组的内源性熊果苷含量在贮藏期间呈整体下降趋势，分别在21和42 d呈双峰模式（图5C）。0 d时，内源性熊果苷含量为41.45 μg g?1。63 d贮藏内，处理组的内源性熊果苷含量高于对照组（p < 0.01），尤其是在峰值时间。

## 3.9 PCA和相关分析

采用PCA（主成分分析）来研究贮藏期间核桃感官品质、品质特性、抗氧化特性和酶活性之间的关系。对照组和处理组PC1和PC2的累积贡献率为91.1%（分别为71.8%和19.3%）。鲜核桃的霉变率、褐变率、AV、PV、MDA、FRAP和PPO活性聚集在一起并在PC1上呈正载荷，而PAL、C4H、4-CL、POD、TYR、DPPH和ABTS•+在PC2上呈正载荷（图6A、B）。这表明PC1综合反映了鲜核桃贮藏期间的品质劣变和脂质氧化程度。

尽管FRAP代表抗氧化能力，但可能会受到褐变产物的干扰，或在储存过程中作为应激反应而增加，从而与品质劣变指标聚集在一起。PC2主要反映了鲜核桃的生理代谢活性和抗氧化防御机制。PAL、C4H和4-CL是苯丙烷途径的关键酶，负责合成酚类化合物，而POD和TYR与酚类氧化有关。下载：下载高分辨率图像（924KB）下载：下载全尺寸图像图6. 鲜核桃在储存期间对照组（A、C、E）和处理组（B、D、E）感官品质、品质属性、抗氧化性能和酶活性的主成分分析（PCA）载荷图、Pearson相关性矩阵，以及内生熊果苷含量与这些指标的相关性矩阵。在相关性矩阵中，左下角的相关系数与其颜色强度成正比，而右上角的椭圆大小与其颜色强度成反比。正相关和负相关分别以红色和蓝色表示。在矩阵中，*表示显著差异（p < 0.05），**表示极显著差异（p < 0.01），***表示极显著差异（p < 0.001）。在这些图中，MI、MIX、BI和BIX分别代表霉变发生率、霉变指数、褐变发生率和褐变指数；而EAC、OC、SSC、SPC、TFC和TPC分别代表内生熊果苷、油脂、可溶性糖、可溶性蛋白、总黄酮和总酚含量。对照组和熊果苷处理组鲜核桃各指标间的相关性模式总体一致（图6C、D）。鲜核桃的霉变发生率与氧化损伤过程密切相关，与代表氧化应激水平的指标（MDA、AV、PV）和与抗氧化能力相关的指标（FRAP、DPPH、ABTS•+）呈显著正相关。这反映了鲜核桃在储存期间氧化应激下主动激活自身抗氧化防御系统的生理响应特征。同时，苯丙烷代谢的关键酶活性，包括PAL、4-CL、PPO和TYR，与霉变发生率呈显著正相关。这些酶活性的增加代表了鲜核桃对霉变侵染和氧化应激的被动防御反应。然而，总酚和总黄酮含量与霉变发生率呈显著负相关，表明这些苯丙烷代谢的次生代谢产物在直接抗霉和延缓氧化方面发挥作用。两组的内生熊果苷含量均与霉变发生率、霉变指数、褐变发生率和褐变指数呈显著负相关，同时与L*值呈正相关，与ΔE*值呈负相关（图6E），表明其在减轻鲜核桃储存过程中霉变和色泽劣变方面的作用。此外，两组的内生熊果苷含量均与可溶性蛋白含量呈负相关，处理组中与可溶性糖含量呈负相关。然而，对照组中与总黄酮含量呈正相关，处理组中与总酚含量呈正相关，提示熊果苷处理促进了总酚的合成。两组中，内生熊果苷含量均与MDA含量、AV和PV呈负相关，表明其在抑制脂质过氧化和油脂酸败方面的积极作用。## 4. 讨论### 4.1 熊果苷处理可能通过抑制鲜核桃壳霉变生长来保持种皮外观外观是鲜核桃商业价值的核心体现，霉变是导致其外观劣变和市场接受度丧失的首要因素，其发展直接影响色泽和质地特征的劣变（Zhang等，2023）。在严重情况下，霉变可能通过多孔的核桃壳渗透污染果仁（Amini和Ghoranneviss，2016）。雾化熏蒸方法可在确保果实表面保持干燥清洁的同时实现更好的抗真菌和保鲜效果，相较于浸泡和喷洒技术具有优势（Zhang等，2025b）。在本研究中，对照组鲜核桃壳表面在储存7 d后出现可见霉斑，而使用100 mg L?1熊果苷进行雾化处理后，霉变的发生延迟至28 d。同时，对照组和处理组的霉变发生率与果仁褐变发生率均呈正相关（r = 0.84；r = 0.88），表明壳霉变和种皮褐变密切相关，熊果苷处理通过抑制壳霉变生长减轻了种皮的褐变程度。TYR是参与黑色素形成的多酚氧化酶，可参与水果和蔬菜的褐变（Xu等，2022）。与对照组相比，作为已知TYR抑制剂的熊果苷降低了鲜核桃在储存过程中PPO和TYR的活性，且褐变发生率与PPO和TYR活性呈正相关（r = 0.88, p < 0.001；r = 0.74, p < 0.001）。这些结果表明，熊果苷处理直接抑制了TYR的催化功能，阻碍了酪氨酸向DQ等褐变中间产物的转化，从源头抑制了褐变反应，从而保持了鲜核桃种皮的较好外观。### 4.2 熊果苷处理延缓霉变生长可能与激活苯丙烷代谢和促进抗氧化能力有关苯丙烷代谢是植物应对生物和非生物胁迫的关键防御途径之一，与果实采后抗病性密切相关（Chen等，2024）。相关酶包括关键的苯丙烷生物合成酶（PAL、C4H和4-CL）和下游酚类氧化酶（PPO和POD）。与对照组相比，熊果苷处理在储存过程中维持了PAL、C4H和4-CL的较高活性水平，同时PPO和POD的活性水平较低，对照组和处理组中PPO活性与总酚含量之间均存在显著负相关（r = ?0.89；r = ?0.89），表明PPO可能是负责酚类化合物氧化降解的关键酶，较低的PPO活性可延缓酚类物质的消耗。酚类化合物参与抗氧化清除、褐变反应、抗菌活性等其他支路途径（Pa?ayeva等，2025；Zhang等，2023）。Zheng等（2024）发现，总酚和黄酮的积累增强了"富士"苹果对病原菌的防御能力。在本研究中，两组鲜核桃的总酚含量在储存过程中均有所下降，这可能是因为酚类消耗仍超过合成，因为酚类通过抗氧化清除和酶促褐变被持续消耗。熊果苷处理显著延缓了总酚含量的下降，这可归因于苯丙烷途径酶活性和基因表达水平的整体上调增强了酚类生物合成。此外，对照组和熊果苷处理组的霉变发生率与总酚和总黄酮含量呈负相关（r = ?0.69；r = ?0.82），表明酚类和黄酮的积累和保留在抑制鲜核桃储存过程中霉变方面发挥重要的调节作用。值得注意的是，两组的DPPH自由基清除能力和FRAP值均有所增加，且处理组的水平始终较高，尽管总酚含量有所下降。我们推测，抗氧化活性可能取决于特定的关键酚类成分，而非储存期间鲜核桃的总酚含量。在基因表达水平上，熊果苷处理显著上调了JrPAL和Jr4-CL等核心苯丙烷合成基因的表达水平，增强了代谢通量，促进了酚类防御物质的合成和积累。此外，JrPOD的表达水平在储存中期明显受到抑制，避免了该时期基因过度表达导致的酚类化合物过度氧化，有效维持了酚类含量。总之，总酚和总黄酮的保留和积累是抑制鲜核桃储存过程中壳表面霉变生长的关键。熊果苷处理较高的总酚水平是增强抗氧化能力和抗病性的共同物质基础。熊果苷的关键作用可能在于通过上调PAL、C4H和4-CL的活性来激活苯丙烷代谢途径，同时防止下游相关酶（POD和PPO）的活性。因此，它增强了总酚和黄酮的稳定积累，有助于维持较高的抗氧化能力和抗病性，最终延缓鲜核桃储存过程中霉变的发生。### 4.3 熊果苷处理增强抗氧化能力并减少脂质氧化，应归因于鲜核桃风味和油脂品质的维持鲜核桃风味和油脂品质的变化是评估储存品质的关键方面。采后果实中的挥发性异味主要包括醛类、醇类、酸类和含硫化合物，来源于发酵、脂质氧化和氨基酸降解（Zhao等，2024）。完整的膜系统对于维持细胞区室化至关重要（Zhu等，2023）。这可能阻止油脂暴露于不利条件下，从而在物理水平上抑制VOCs的挥发和脂质氧化。醛类是过氧化物分解产生的主要次级脂质氧化产物。它们可以攻击核酸和内源性抗氧化剂的巯基，导致细胞氧化应激和生物损伤，是油酸和亚油酸的重要氧化降解产物（Zhao等，2025）。Zhou等（2023）认为，丁醛主要来自不饱和脂肪酸的氧化。此外，酮类也是通过脂质经酶促或非酶促途径产生的脂质过氧化物进一步氧化而形成的（Xiong等，2025）。坚果储存过程中醛类和酮类的大量积累是脂质氧化降解的典型标志，这些化合物赋予的油腻和酸败气味是鲜核桃感官劣变的直接原因（Huo等，2024）。在本研究中，从初始阶段到储存63 d，与氧化酸败密切相关的挥发性醛类含量在对照组中高于处理组，表明熊果苷处理能显著抑制这些不良气味物质的产生。同时，在63 d时处理组的含硫挥发性物质含量高于对照组。鉴于鲜核桃的高脂质和蛋白质含量，这可能表明储存后期风味稳定性的潜在风险。处理组中较低的含氮挥发性物质含量可归因于对微生物生长的抑制，这种抑制可能减少了微生物对含氮氨基酸的分解。此外，尽管两组在储存过程中VOCs含量均有损失，但对照组的VOCs总量仍在增加，主要是由于与氧化酸败相关的醛类和酮类的积累。单个挥发性化合物对整体风味的贡献高度依赖于其气味阈值和浓度（Zhao等，2024）。某些醛类，如低水平的己醛，可能赋予清新的绿色气息，但相同化合物在高浓度下通常被感知为酸败味。在本研究中，熊果苷处理组醛类的减少伴随着较低的AV和PV值，支持了脂质氧化的减少有助于这些醛类减少的观点。AV、PV和MDA含量是评估鲜核桃脂质氧化过程的重要指标（Yang等，2025b）。熊果苷处理增强了整体抗氧化水平，同时有效延缓了鲜核桃的脂质氧化过程。对照组和处理组中AV值与总酚含量之间均存在显著负相关（r = ?0.93；r = ?0.88），而AV值与FRAP值以及DPPH自由基清除能力之间则呈显著正相关（r = 0.83；r = 0.80）。这些结果表明，酚类物质的保留可以有效抑制AV的升高并延缓油脂氧化过程。对于在氧化应激加重的储存条件下，脂质氧化产物的积累与应激诱导的抗氧化系统增强密切相关。

此外，在储存 14-56 天期间，熊果苷处理组的 MDA 含量低于对照组，且 MDA 含量与 AV 及 PV 之间观察到显著的正相关关系 (r = 0.83；r = 0.85)。这些结果共同表明，熊果苷喷雾处理可以系统性地增强抗氧化能力，维持细胞膜结构完整性和油脂稳定性，同时阻断油脂哈败和异味挥发性化合物的生成途径，最终在储存期间有效保持鲜核桃的特征风味轮廓。此外，储存期间两组的可溶性糖和可溶性蛋白含量均逐渐增加，但熊果苷处理组总体较低。Yang 等人 (2025) 也报道了可溶性糖含量的类似趋势。可溶性糖积累的减少可能反映了熊果苷处理下碳水化合物水解的延迟。可溶性蛋白含量的增加可能是由于不溶性蛋白降解为可溶性片段，或者是防御和抗氧化酶的积累所致。

4.4. 失重、被动气调包装及安全性对熊果苷保鲜的影响
本研究主要侧重于分析表型、生化和基因表达数据，为熊果苷处理在鲜核桃保鲜中的调控机制提供了初步见解。然而，一些其他潜在相关因素仍需要考虑，包括失重、被动气调包装和安全性评估。

失重率主要取决于水分流失和呼吸消耗，极大影响鲜核桃采后的外观、质构和易受霉菌侵害程度 (Reitz 和 Mitcham, 2023, Zhang 等，2023)。苹果的汁液性与脆度密切相关 (Poles 等，2020)。抗菌处理通常会减少果实的失重和呼吸消耗 (Koyuncu 等，2023, Zhang 等，2022)。在本研究中，所有指标均以鲜重为基础表示。熊果苷处理保持了更好的脆度，间接表明其水分流失较低。我们推测，熊果苷可能直接作用于细胞，通过抗氧化调节维持膜完整性，从而降低水分渗透性；或者，它可能仅仅抑制霉菌而不改变组织的水分特性。

值得注意的是，仅在 42 天时，熊果苷组的脂肪内容量高于对照组。尽管所有样品都在相同的环境条件下储存，但这种差异可能反映了真实的脂质变化，也可能受到水分流失的混淆。当鲜核桃用 40 μm 聚乙烯进行气调包装时，其呼吸作用和表面微生物活动消耗 O? 并释放 CO?，在包装内形成低 O? 和高 CO? 的环境。熊果苷处理对鲜核桃的保鲜效果可能归因于其生理调节、抗菌活性和被动气调包装之间的协同相互作用。未来研究将考虑使用适当的实验设计，如非包装对照，来研究熊果苷处理在储存期间对鲜核桃的独立影响。

总体而言，本研究中外源熊果苷的应用显著增加了果仁中的熊果苷含量，这可能是由诱导的内源熊果苷生物合成或外源施加的熊果苷所致。结合上述质量改善，这证明了熊果苷处理在储存期间对鲜核桃的保鲜潜力。然而，在这些发现转化为商业实践之前，仍需要进一步评估。遵循其他采后防腐剂的评价框架，熊果苷作为采后处理的实用价值应通过平衡保鲜效果、剂量、可食用组织中的残留量以及消费者接受度来进行评估。尽管之前的研究 (Fuentealba 等，2017) 和本研究都报道了熊果苷在核桃果仁中的天然存在，但其外源使用仍需要评估剂量的适当性和膳食摄入风险。核桃壳可能作为物理屏障限制熊果苷迁移到果仁中，因此如果残留物主要留在不可食用的壳上，可能潜在地减少消费者暴露。在本研究中，储存期间处理组果仁中最高内源熊果苷含量为 68.46 μg g?1（即 mg kg?1），在峰值时仅比对照组高 10.33 μg g?1。Nazeer 等人 (2025) 报道，熊果苷在通过腹腔注射给药剂量高达 7000 mg kg?1 体重时在斯普ague-达利大鼠中耐受性良好，未引起器官和体重的显著变化。这表明 100 mg L?1 外源熊果苷处理的相对安全性。未来，在熊果苷商业化应用于鲜核桃之前，将进一步研究其膳食摄入影响。

5. 结论
100 mg L?1 熊果苷喷雾处理显著延迟了鲜核桃在 0 ± 1 °C 下的霉变发生，并保持了营养成分、油脂质量和与风味相关的关键感官属性。其关键作用可能主要是通过上调关键苯丙烷生物合成酶 (PAL、C4H 和 4-CL) 的活性以及相应基因 JrPAL 和 Jr4-CL 的表达水平来激活苯丙烷代谢途径，同时抑制 PPO、POD 和 TYR 的活性以及 JrPOD 基因的表达水平。这些效果进一步促进了防御性酚类和黄酮类化合物的合成与积累，从而增强抗氧化活性并抑制脂质氧化，导致 AV、PV 和 MDA 含量显著降低，从而保持鲜核桃的储存质量。本研究将为熊果苷在鲜核桃及其他高脂坚果采后保鲜中的进一步应用研究提供理论依据。

CRediT 作者贡献声明
柳超宾：监督，构思。张婷：写作 – 审阅与编辑，监督，构思。马艳平：写作 – 审阅与编辑，监督，资源，资金获取，构思。李计宗：写作 – 原稿，可视化，方法论，调查，形式化分析，数据整理，构思。艾比拜·尼雅孜：可视化，方法论，形式化分析，数据整理，构思。王玉春：可视化，数据整理，构思。苟远林：数据整理，构思。曹瑞源：调查。马晓兰：调查。

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