《Aging Cell》：Rethinking Senescence Hallmarks in the Brain: Lessons From Peripheral Tissues and Challenges in Defining Neuronal Senescence
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细胞衰老日益被认为是衰老和年龄相关疾病的基本驱动因素。对外周组织的研究揭示，衰老并非一种统一的细胞状态，而是一种高度异质性的表型，由DNA损伤、线粒体功能障碍、染色质重塑、蛋白质稳态受损以及多种衰老相关分泌表型（SASP）的不同组合所塑造。这种异质性对衰老细胞
细胞衰老日益被认为是衰老和年龄相关疾病的基本驱动因素。对外周组织的研究揭示，衰老并非一种统一的细胞状态，而是一种高度异质性的表型，由DNA损伤、线粒体功能障碍、染色质重塑、蛋白质稳态受损以及多种衰老相关分泌表型（SASP）的不同组合所塑造。这种异质性对衰老细胞的识别和治疗靶向均产生关键影响。随着衰老细胞随年龄增长而累积，它们促进慢性低度炎症和组织功能障碍，而其选择性清除可改善健康寿命，从而确立衰老既是系统性衰老中的致病机制，也是治疗靶点。新兴证据表明，有丝分裂后神经元及其他神经细胞类型在衰老和神经退行性变过程中可获得衰老样状态。然而，将经典的外周衰老标志直接应用于神经系统在概念上和实验上仍存在问题，可能导致不同模型和研究之间不一致或误导性的解读。在本综述中，研究人员整合外周衰老生物学的见解，考察细胞类型、诱导应激源和实验背景如何塑造神经系统中各模型（包括体外模型、生理性衰老大脑以及阿尔茨海默病和帕金森病模型）的衰老相关表型。通过批判性评估经典衰老标志在何处可转化、在何处无法转化为有丝分裂后神经元，研究人员提出，建立精细化的、以神经元为中心的框架对于推动该领域超越描述性观察，并严格检验衰老神经细胞对神经退行性变的因果贡献至关重要。
1 引言
细胞衰老以不可逆的细胞周期停滞和独特的表型变化为特征，在衰老过程中发挥关键作用。主要标志包括细胞形态改变、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性升高、DNA损伤、染色质重组、p16INK4a和p21Waf1/Cip1等细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂水平升高、Bcl-2和Bcl-xL等抗凋亡蛋白上调、活性氧（ROS）产生增强，以及衰老相关分泌表型（SASP）。SASP包括IL-1和IL-6等炎症细胞因子、血管内皮生长因子等生长因子以及基质金属蛋白酶等蛋白酶的分泌增加。细胞衰老体现了拮抗性多效性，在生命早期提供生存和繁殖优势，但在衰老后期产生不利影响。年轻时，衰老通过招募免疫系统清除受损或潜在恶性细胞来维持组织稳态；随着年龄增长，免疫监视和衰老细胞清除能力下降，导致其累积并建立持续促炎微环境，促成2型糖尿病、心血管疾病和癌症等年龄相关疾病的发生发展。动物研究表明清除衰老细胞可改善疾病表型并延长寿命，凸显了选择性靶向这些细胞的抗衰老药物的治疗前景。
在神经系统中研究细胞衰老本质上具有挑战性，因为没有单一标志物能同时具备特异性和普遍适用性来定义脑组织中的衰老细胞。经典衰老标志也可由细胞应激、炎症或分化诱导，其表达随细胞类型、衰老诱导剂和实验背景而变化。脑组织中p16INK4a的免疫检测尤其困难，因其基线表达低且抗体特异性多变，此类数据应谨慎解读。这些问题因实验系统之间的差异而更加复杂，包括永生化神经元细胞系、原代神经元培养、神经元-胶质细胞混合系统、动物模型和人类死后组织，每种系统捕捉应激和衰老的不同侧面，并可能塑造相应的衰老相关表型。因此，可靠识别衰老需要整合多种互补标志物，并批判性评估数据来源的实验系统。图1总结了在增殖细胞中定义衰老与在终末分化神经元中识别衰老样状态的证据层级差异。
2 从外周组织到中枢神经系统
治疗性靶向衰老细胞的前景引发了关于如何识别这些细胞及其对抗衰老药物干预敏感性的基本问题。尽管衰老研究在生理和病理环境中取得重大进展，但大多数可用数据仍来自外周组织中具有有丝分裂活性的细胞。外周研究积累揭示了用于监测衰老表型的标志物存在显著异质性，并强化了衰老反应高度依赖背景的观点。表型组成受诱导刺激、应激强度和持续时间、细胞类型、衰老阶段、调控通路及周围微环境影响，强调需要并行监测和量化多种标志物以可靠识别衰老细胞。
基于外周组织的见解，中枢神经系统（CNS）衰老研究最初集中于具有有丝分裂活性的胶质细胞。大量研究报道在正常衰老和肌萎缩侧索硬化、多发性硬化、阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）等慢性疾病过程中，哺乳动物大脑中具有衰老相关特征的细胞增多。胶质细胞似乎特别容易发生复制性衰老和应激诱导衰老，通过功能损伤和SASP分泌损害CNS稳态。结合年龄相关的脑细胞丢失，这种破坏可导致突触损伤、特定神经元群体丢失、白质萎缩及随之而来的认知和运动衰退。与外周组织中的发现类似，选择性清除衰老胶质细胞已在动物模型中改善行为和认知缺陷。关键转折点是Jurk等人的工作，他们证明不仅增殖性胶质细胞，非分裂的终末分化神经元也能获得衰老样表型。
3 衰老模型中的神经元衰老
3.1 长期培养作为体外衰老模型
长期培养（LTC）是模拟体外衰老的有效工具，尤其用于诱导成纤维细胞和上皮细胞等分裂细胞衰老。Moreno-Blas等人使用孕鼠皮层培养维持至40天体外培养（DIV）建立LTC衰老模型。26 DIV时神经元占培养细胞的51%，40 DIV时胶质细胞占主导（73%）。无外部刺激下，这些神经元开始表现衰老特征，包括SA-β-gal活性升高、脂褐素累积和核形态改变。但具有高SA-β-gal活性但核形态保留的神经元存在，强调了SA-β-gal作为独立神经元衰老标志的可靠性有限。26 DIV时，神经元而非胶质细胞显示p21Waf1/Cip1和γH2AX灶增加，提示神经元可能在该模型中先于胶质细胞进入衰老状态，可能由DNA损伤反应（DDR）通路刺激。自噬受损也明显，表现为LC3阳性斑点累积伴p62水平升高，提示长期培养神经元中自噬降解受损和自噬通量降低。同时出现SASP相关改变，包括SASP相关转录因子GATA4的神经元内累积和选择性细胞因子表达变化，最显著的是MCP-1升高。由于这些长期皮层培养同时含神经元和星形胶质细胞，条件培养基中测得的SASP谱可能反映两种细胞类型的综合贡献。关于SASP的旁分泌效应，长期混合皮层培养的条件培养基在胶质细胞和成纤维细胞中诱导衰老样变化，但在早期传代神经元中未诱导，表明旁分泌SASP效应具有细胞类型和年龄特异性易感性。
原代大鼠海马神经元（PHNs）在LTC条件下（28 DIV）也表现衰老标志，包括SA-β-gal阳性、核异常、Lamin B1丢失、染色质重组、p16INK4a上调、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）激活、GATA4累积及CXCL-1等SASP组分增加。值得注意的是，这些变化在无明显DNA双链断裂或p21Waf1/Cip1表达增加的情况下观察到。PHNs表现蛋白质稳态失败，以泛素化蛋白和淀粉样蛋白β（Aβ）聚集物累积为特征，与衰老和AD病理特征高度相似。自噬通量分析显示早期时间点（7-14 DIV）自噬活跃，28 DIV时下降。雷帕霉素介导的mTOR通路抑制改善了PHNs中的衰老特征，提示该通路在维持神经元健康中的作用。有趣的是，28 DIV时PHNs表现出增强的应激韧性、促生存因子Bcl-2上调和促凋亡Puma下调，表明神经元衰老可能在慢性应激条件下发挥保护性促生存功能。
3.2 生理性脑衰老的证据：小鼠自然衰老
2012年，Jurk等人提出了挑战细胞衰老传统认知的发现，将研究范围扩展至有丝分裂后细胞。他们对广泛使用的C57BL/6近交系小鼠的研究揭示了多种神经元亚型在衰老过程中出现衰老样表型。老年小鼠小脑切片显示SA-β-gal活性升高、γH2AX、p38 MAPK激活、IL-6和脂褐素累积等明显衰老迹象。32月龄小鼠的浦肯野神经元与4月龄相比，DNA损伤增加、p38 MAPK激活、脂质过氧化标志物4-羟基壬烯醛累积以及IL-6和脂褐素水平升高。老年皮层神经元同样表现衰老相关变化，部分以异染色质中组蛋白变体macroH2A沉积增加为特征。Jurk等人进一步探索了p21Waf1/Cip1和端粒酶活性在老年小鼠神经元衰老中的作用。CDKN1A（编码p21Waf1/Cip1的基因）敲除减少了若干衰老相关标志物，但仅4-羟基壬烯醛水平与野生型相比显著变化。相反，端粒酶缺失导致端粒功能障碍、更强的DDR和更高IL-6水平、p38 MAPK激活及浦肯野和皮层神经元氧化应激增加。值得注意的是，CDKN1A和端粒酶基因双敲除小鼠揭示这些效应依赖于DDR激活下游的p21Waf1/Cip1信号。轻度饮食限制减少了浦肯野细胞中的衰老相关标志物。总之，这些数据支持生理性衰老促进DNA损伤和衰老样促炎神经元状态、且可部分通过饮食干预缓解的模型。
4 神经元衰老与神经退行性变
神经系统的深入衰老研究对年龄相关神经退行性疾病（NDs）研究尤其具有吸引力，可增强对疾病相关机制的理解并作为新的治疗途径。NDs是一组异质性进行性病理，以选择性易损神经元群体逐渐丧失为特征，包括淀粉样变性（如AD）、tau蛋白病（如AD、进行性核上性麻痹）、α-突触核蛋白病（如PD）和TAR DNA结合蛋白43蛋白病。尽管病因和临床表现各异，NDs共享基本特征，包括细胞内氧化应激和神经炎症增加，与细胞衰老特征惊人地平行。
4.1 毒素诱导的神经退行性变模型中的神经元衰老
鱼藤酮是一种与PD病理相关的天然农药，已被用于研究线粒体应激和LRRK2激活是否促进神经元衰老样变化。慢性低剂量鱼藤酮暴露上调富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2），一种参与突触传递、膜运输、细胞骨架重塑及多种底物磷酸化的多功能酶。Ho等人用人多巴胺能（DA）神经元样细胞（分化SH-SY5Y细胞）处理鱼藤酮（1μM）伴或不伴LRRK2激酶抑制剂GSK2578215A 48小时。处理导致LRRK2表达和激活增加、SA-β-gal升高、p53和p21Waf1/Cip1合成增加、磷酸化Rb水平降低、自噬-溶酶体通路受损、ROS产生增加以及α-突触核蛋白（α-syn）累积增强。GSK2578215A共处理缓解了所有这些特征。这些发现在原代大鼠皮层神经元中得到重复，p16INK4a表达无显著变化，强化了鱼藤酮诱导的衰老主要通过LRRK2激酶活性和自噬受损驱动的p53-p21Waf1/Cip1轴运作、导致α-syn累积的观点。体内研究中，鱼藤酮给药导致SA-β-gal活性显著增加（MLi-2显著降低）和纤维状α-syn寡聚体累积增加（MLi-2共处理轻微减弱）。鱼藤酮似乎主要通过LRRK2活性上调促进细胞衰老和α-syn聚集，提示该激酶的药理学抑制可能提供潜在治疗策略。
1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）是常用于PD细胞模型的神经毒素，对黑质致密部（SNpc）DA神经元具有选择性毒性。在大鼠DA N27细胞中，640μM MPP+处理24小时降低Lamin B1并增加p16INK4a和p21Waf1/Cip1。这些发现暗示MPP+可能在DA神经元因过度神经毒性应激而退化前诱导其衰老。
4.2 年龄相关神经退行性疾病中的神经元衰老
4.2.1 AD中的衰老
AD是老年人痴呆最常见的病因，分子水平以细胞外淀粉样斑块（主要由淀粉样蛋白β（Aβ）组成）和神经原纤维缠结（NFTs）（主要由过度磷酸化tau组成）为特征。在细胞模型中，寡聚Aβ1-42（Aβ42）被证明通过诱导衰老支持AD相关病理过程。高浓度Aβ42（10μM）增加凋亡，较低浓度（2.5-5μM）降低细胞增殖和分化能力同时增加凋亡抗性，与衰老状态诱导一致。衰老样NPCs表现神经球尺寸减小、突起缩短、β-III-微管蛋白和GFAP表达降低，表明神经发生和分化受损。APP/PS1转基因小鼠齿状回中检测到更多具有衰老相关特征的NPCs。机制上，Aβ42似乎通过甲酰肽受体2（FPR2）和ROS-p38 MAPK信号通路激活发挥作用。
Herdy等人将16名AD患者和19名非痴呆对照的成纤维细胞直接转化为诱导神经元（iNs）。AD iNs显示CDKN2A、MMP3、CXCL5/8和IL-6等衰老和炎症相关基因显著上调，伴随神经元特异性功能基因下调。表观基因组分析显示AD iNs中衰老相关基因转录起始位点对转录因子更可及，ETS1被牵涉驱动基因表达。AD iNs条件培养基含SASP因子，激活星形胶质细胞，诱导反应性星形胶质增生和衰老特征。达沙替尼和槲皮素治疗将衰老神经元比例降至对照水平。
在5XFAD小鼠模型中，海马CDKN2A表达从约7月龄起显著增加，p53或p21Waf1/Cip1仅在后期（18月龄）上调。CDKN2A/p16INK4a表达增加与认知表现负相关。在rTg(tauP301L)4510（tauNFT）转基因小鼠中，海马显示γH2AX、CDKN2A、CDKN1A水平升高，TLR4、TNFα、CXCL1和IL-1β等SASP相关因子表达增加2-13倍。衰老相关线粒体功能障碍仅在持续tau病理的脑区观察到。达沙替尼和槲皮素治疗增加神经元特异性蛋白、增强脑血流并减少神经退行性变。人类AD脑尸检显示富含神经元的前额叶皮层CDKN2A表达增加，AD患者脑脊液中MMP-10、STAMBP和EIF4EBP1等蛋白升高。一项涉及76个人类尸检脑的研究揭示，超过97%表现衰老样表型的细胞（以形态改变、脂褐素累积和p19表达增加为特征）是兴奋性神经元，且与NFTs空间重合。
4.2.2 PD中的衰老
PD是第二大常见ND，以SNpc中DA神经元丢失和α-syn聚集物（路易小体）增加为特征。特殊AT富集序列结合蛋白1（SATB1）被确定为PD相关遗传因素。SATB1缺失的DA神经元体外表现衰老样特征，包括SA-β-gal活性增加、核形态改变、Lamin B1降低、p21Waf1/Cip1升高、溶酶体功能障碍、蛋白质稳态缺陷、ROS累积和线粒体损伤，但无DNA损伤或p16INK4a上调。阿奇霉素、非瑟酮、达沙替尼/槲皮素选择性降低SATB1缺陷DA神经元活力。机制上，SATB1结合CDKN1A调控区并抑制p21Waf1/Cip1表达，其缺失增强p21Waf1/Cip1水平和衰老。SATB1缺失未在皮层神经元中诱导衰老，强调其细胞类型特异性作用。
Verma等人用α-syn预形成纤维（PFFs）处理多种CNS细胞类型。大鼠N27 DA神经元中，α-syn PFFs暴露降低Lamin B1和SATB1水平，p21Waf1/Cip1在12小时短暂上调后48小时下降，p16INK4a意外降低。原代大鼠皮层神经元中p21Waf1/Cip1在48小时内增加但72小时下降。3天处理在原代胶质细胞中诱导衰老。Yoon等人通过重组腺病毒载体在SH-SY5Y中异位表达α-syn，显示p53和p21Waf1/Cip1早期上调、SA-β-gal阳性细胞增加、H3K9三甲基化水平升高及线粒体异常。在稳定过表达A53T α-syn突变体的PC12细胞中，SA-β-gal、p16INK4a和p21Waf1/Cip1显著上调，铁过载条件下进一步增加并伴随ROS产生升高。
在体内，SATB1下调小鼠模型显示酪氨酸羟化酶（TH）丢失、脂褐素累积、CDKN1A和SASP因子（如CCL-1）上调，且p16INK4a在对照和SATB1缺陷DA神经元中均缺失。PD患者尸检SNpc中DA神经元CDKN1A显著上调。注射α-syn PFFs的小鼠5-6个月后显示Lamin B1和p16INK4a降低，p21Waf1/Cip1增加。人类PD样本显示Lamin B1和SATB1显著降低，p21Waf1/Cip1升高。α-syn-A53T过表达小鼠在1周时即显示SA-β-gal、γH2AX、p16INK4a、p21Waf1/Cip1、脂褐素累积、线粒体功能障碍、氧化应激、铁失调及促炎细胞因子水平显著增加，先于DA神经元丢失和运动功能障碍。铁螯合剂去铁胺治疗改善了铁失调、小胶质细胞激活及p16INK4a和p21Waf1/Cip1表达。
4.3 脑衰老和神经退行性变中的胶质和血管衰老
星形胶质细胞是神经血管单元的核心组分。衰老星形胶质细胞（星形胶质细胞衰老）表现SA-β-gal活性、p16INK4a和p21Waf1/Cip1上调、DNA损伤灶、Lamin B1丢失和染色质重组，以及富含IL-6、IL-8、IL-1β和基质金属蛋白酶（MMPs）的SASP。AD中p16INK4a和MMP-1阳性衰老星形胶质细胞在皮层和海马累积。PD患者黑质中星形胶质细胞核尺寸增大、SA-β-gal、p16INK4a、IL-6、IL-1α、IL-8和MMP-3增加，Lamin B1降低。百草枯暴露诱导星形胶质细胞衰老和促炎SASP，清除p16INK4a阳性细胞保留黑质纹状体DA神经元并改善运动表现。小胶质细胞也显示衰老样状态转变，以吞噬功能受损、铁累积和SASP样细胞因子谱为特征。脑血管内皮细胞衰老表现为细胞周期停滞、线粒体功能障碍、一氧化氮生物利用度降低、内皮素和ROS增加及紧密连接蛋白下调或错误定位，促进血脑屏障（BBB）渗漏和神经血管解偶联。近期小鼠研究表明衰老微血管内皮细胞是神经血管偶联缺陷和认知衰退的关键驱动因素，而衰老细胞清除恢复BBB完整性、毛细血管密度和学习表现。
4.4 神经元衰老研究的未来实验框架
外周组织进展对定义衰老分子标志至关重要，但将这些概念转化至大脑暴露了实验系统、标志物甚至分类标准上的显著分歧。神经元研究常依赖不同的标志物组合，常得出部分重叠的衰老定义。经典衰老标志如p16INK4a、p21Waf1/Cip1和γH2AX在脑研究中广泛使用，但其在有丝分裂后神经元中的特异性和可靠性不确定。新兴单细胞和单核分析表明神经元衰老相关特征呈镶嵌式分布，随细胞类型、脑区和疾病阶段而异，且仅与经典衰老特征部分重叠。关键下一步是系统开发精细化的、以神经元为中心的衰老标志物组合，应基于多种体外和体内模型的综合实验证据，并由转录组、表观遗传和功能读数支持。多组学方法为实现此目标提供实用途径，整合单核RNA测序与空间转录组学和蛋白质组学正在绘制细胞类型特异性衰老轨迹。当前证据表明神经元衰老不太可能在神经退行性疾病中扮演单一统一角色，而是一种背景依赖性过程，可能在不同阶段作为易感状态、疾病促进催化剂或加重因素发挥作用。
