《HUMAN MUTATION》：A Novel Technique for Validating Copy Number Variants and Its Application in Familial Exudative Vitreoretinopathy
编辑推荐：
中文摘要：遗传性疾病具有强烈的遗传基础，其中拷贝数变异（copy number variants，CNVs）在其发病机制中扮演关键角色。然而，CNVs的检测与验证仍具挑战性。在本研究中，研究人员引入靶向富集聚合酶链反应（target enrichment po
中文摘要：遗传性疾病具有强烈的遗传基础，其中拷贝数变异（copy number variants，CNVs）在其发病机制中扮演关键角色。然而，CNVs的检测与验证仍具挑战性。在本研究中，研究人员引入靶向富集聚合酶链反应（target enrichment polymerase chain reaction，tecPCR），这是一种将多重聚合酶链反应（multiplex polymerase chain reaction，PCR）与二代测序（next-generation sequencing，NGS）相结合的新型技术，用于增强CNV验证能力，并将其应用于家族性渗出性玻璃体视网膜病变（familial exudative vitreoretinopathy，FEVR）。利用NGS，研究人员鉴定了97个与FEVR相关的变异，包括91个单核苷酸变异（single nucleotide variants，SNVs）和6个CNVs。其中，66.67%（4/6）的CNVs同时通过定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）和tecPCR得到验证，在本次初步验证中，tecPCR的阳性预测值为100%（95%置信区间：39.8%–100%），阴性预测值为100%（95%置信区间：15.8%–100%）。经验证的FEVR基因检测阳性率为53.07%（95/179）。此外，携带CNVs的FEVR患者的人口统计学特征和眼部特征与携带SNVs的患者相当。本研究拓宽了FEVR的突变谱，并证明tecPCR具有卓越的特异性和敏感性，使其成为遗传诊断中一种有前景的工具。
论文解读文章
一、研究背景与目的
家族性渗出性玻璃体视网膜病变（familial exudative vitreoretinopathy，FEVR）是一种罕见的、遗传异质性较强的视网膜血管发育异常疾病，在新生儿中的发病率约为0.11%。该病由视网膜血管发育不完全或异常引起，可导致视网膜皱襞、视网膜脱离、新生血管形成甚至失明。目前已发现超过11个FEVR相关基因，包括FZD4、NDP、LRP5、TSPAN12、ZNF408、KIF11、CTNNB1、JAG1和ATOH7等。然而，FEVR的致病变异大多为单核苷酸变异（single nucleotide variants，SNVs），拷贝数变异（copy number variants，CNVs）的检出率很低。基于二代测序（next-generation sequencing，NGS）的CNV检测在FEVR中的阳性预测值变化较大（10%–80%），且存在灵敏度低、可重复性差和假阳性风险高等问题。因此，在NGS筛选出可疑CNV后，通常需要额外的基因剂量分析方法进行验证。本研究旨在设计一种新型的CNV验证技术——靶向富集聚合酶链反应（target enrichment polymerase chain reaction，tecPCR），该技术将多重聚合酶链反应（multiplex polymerase chain reaction，PCR）与NGS相结合，可在一个反应中同时灵敏地检测多个基因位点的拷贝数变化，并与公认的定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）方法进行比较，同时分析携带SNVs和CNVs的FEVR患者临床表型的差异，以拓展FEVR的突变谱并提高遗传诊断的准确性。
二、主要技术方法
研究人员从2017年至2024年间，在复旦大学附属眼耳鼻喉科医院纳入了179个FEVR先证者及散发病例，采集外周血白细胞基因组DNA，采用XGen Exome Research Panel v1.0进行外显子捕获，并在Illumina HiSeq4000平台进行150 bp双端测序。测序数据经fastp、cutadapt、Sentieon等流程进行质控、比对和变异检测。SNVs和小的插入/缺失（indels）通过Sentieon Haplotyper鉴定，并用Sanger测序验证。全基因组CNV分析使用CNVkit软件，结合全基因组范围约0.3 Mb间隔的探针设计，通过比较目标区域与背景区域的测序深度推断拷贝数变化。对NGS检出的可疑CNV，分别采用qPCR和tecPCR进行验证。tecPCR流程包括：基因组DNA片段化后连接独特分子标识（unique molecular identifiers，UMIs）构建预文库，然后使用基因特异性引物进行靶向富集，经样本索引和扩增后进行高通量测序。统计分析采用SPSS 23.0，使用t检验、Mann-Whitney U检验、卡方检验及广义估计方程（generalized estimating equation，GEE）模型进行组间比较。
三、研究结果
（一）遗传学分析
在179个无关家系中，NGS检出了97个家系携带致病变异，包括91个SNVs和6个CNVs。所有SNVs均经Sanger测序验证。SNVs在基因分布上：FZD4 37个（40.66%）、LRP5 29个（31.87%）、TSPAN12 9个（9.89%）、NDP 6个（6.59%）、CTNNB1 4个（4.40%）、ZNF408 3个（3.30%）、KIF11 3个（3.30%）。变异类型包括错义变异62个（68.13%）、无义变异11个（12.09%）、移码变异11个（12.09%）、内含子变异6个（6.59%）和同义变异1个（1.10%）。6个NGS检出的CNVs均未发现其他致病性SNVs或多态性变异，被认为是潜在致病变异。这些CNVs均为新发变异，其中2个位于LRP5，2个位于NDP，1个位于FZD4，1个位于TSPAN12；变异类型包括4个杂合缺失、1个纯合缺失和1个杂合重复。
（二）CNV验证
通过qPCR验证，6个NGS检出的CNVs中有4个得到确认（家系122、128、138、149），另外2个（家系70的LRP5外显子18缺失和家系131的LRP5外显子1缺失）被证实为假阳性。tecPCR结果与qPCR高度一致，同样成功检出了3个缺失和1个重复，并验证了2个假阳性CNV。由此得出tecPCR的阳性预测值为100%（95%置信区间：39.8%–100%），阴性预测值为100%（95%置信区间：15.8%–100%）。与qPCR相比，tecPCR只需一次实验即可完成验证，而qPCR需要多轮引物设计和优化。此外，qPCR引物用于断点检测的GC含量显著高于tecPCR引物，部分qPCR引物GC含量甚至超过60%。所有经验证的CNVs均未在健康对照中检出，也与DGV Gold Standard数据集中的良性变异无重叠。在179个FEVR先证者及散发病例中，95个携带已知FEVR相关基因的致病或可能致病变异，总体分子诊断率为53.07%。
（三）携带CNVs的FEVR患者临床表现
4个经确认的CNV先证者表现出典型的FEVR眼部特征。先证者122（NDP外显子2–3杂合缺失）因左眼白瞳症就诊，右眼存在周边无灌注区、视网膜小动脉角度减小和颞侧玻璃体视网膜牵拉，白内障术后左眼出现视网膜皱襞。先证者128（FZD4外显子1–2杂合缺失）双眼表现高度不对称，右眼可见周边无灌注区、视网膜皱襞、血管分支变直、视网膜新生血管和血管渗漏，左眼仅见周边无灌注区。先证者138（TSPAN12外显子2–4杂合缺失）表现为轻型FEVR。先证者149（NDP外显子2杂合重复）表现为单侧视网膜脱离。对FZD4、TSPAN12和NDP基因的CNV组与SNV组进行比较，两组在发病年龄、性别比例、基因型分布方面差异均无统计学意义（均p > 0.05）。眼部特征方面，最佳矫正视力（best corrected visual acuity，BCVA）、眼轴长度、眼压、视网膜皱襞发生率和FEVR分期在两组间也均无显著差异（均p > 0.05）。GEE敏感性分析结果与原分析一致。CNV组的眼部表现并无特异性，视网膜皱襞、玻璃体视网膜牵拉、周边无血管区、视网膜新生血管和视网膜脱离等典型FEVR表现同样见于SNV组。
四、讨论与结论
本研究表明，NGS在检测CNV方面具有一定潜力，但存在假阳性风险，尤其是对于长度仅数百或数十碱基对、局限于同一外显子内的短CNV。研究检出的2个假阳性CNV（LRP5外显子18的238 bp缺失和LRP5外显子1的92 bp缺失）正是由于区域GC含量高或测序深度不足导致。因此，NGS筛出CNV后必须进行后续验证。与传统的qPCR相比，tecPCR具有多项优势：其单端特异性引物序列较长，降低了非特异性扩增；UMI的引入可区分真实变异和假阳性；针对特定外显子/内含子设计的基因特异性引物可重复使用，无需针对不同CNV断点反复设计引物；且引物设计可避开高GC区域。在本研究中，所有qPCR实验虽均成功，但需要多轮特异性引物设计，而tecPCR一次即成功，效率更高。tecPCR与qPCR结果的一致性验证了其可靠性。既往研究提示NDP基因CNV与较严重的眼部表型相关，本研究中NDP外显子2重复的先证者出现单侧全视网膜脱离，NDP外显子2–3缺失的女性携带者表现为先天性白内障、玻璃体视网膜牵拉和视网膜皱襞，支持NDP为剂量敏感基因。TSPAN12和FZD4的CNV则与轻型、不对称表型相关。尽管CNVs影响基因组更大范围，但本研究未发现其导致比SNVs更严重的FEVR表型，两组眼部特征相似。研究的局限性在于CNV携带者数量较少，对表型效应的认识有限，且对tecPCR准确性的初步评估受限于小样本和缺乏独立金标准，未来需要更大规模的前瞻性多中心研究加以验证。总之，研究人员引入了tecPCR这一新型CNV验证技术，相比传统方法具有更高的检测效率和更低的非特异性扩增风险，有望简化特定遗传病的CNV检测流程，为遗传诊断提供有力工具。该研究发表在《HUMAN MUTATION》。
