美利奴羊、阿卡拉曼羊和基维茨克羊品种的脂肪酸组成、骨骼肌DGAT1、FABP4和IGF1的表达及蛋白质-蛋白质相互作用网络

《JOURNAL OF FOOD QUALITY》：Fatty Acid Composition; Skeletal Muscle Expression of DGAT1, FABP4, and IGF1; and Protein–Protein Interaction Networks in Merino, Akkaraman, and Kivircik Sheep Breeds

　　

羊生产是全球畜牧业的重要组成部分，理解品种相关的肌肉脂肪酸组成和营养脂质价值差异对于现代生产体系至关重要。本研究调查了三种代表不同尾部形态的绵羊品种的臀中肌脂肪酸组成与关键脂质和生长相关基因（DGAT1、FABP4和IGF1）表达之间的关系。研究人员从美利奴羊（短、薄尾型）、阿卡拉曼羊（肥尾型）和基维茨克羊（长、薄尾型）三个品种中各选取6只雄性羔羊（n=6每品种），在相同管理条件下饲养。采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析脂肪酸组成，分别通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白质印迹法（Western blot）量化基因和蛋白质表达水平。还构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络以阐明潜在的分子背景。基维茨克羊羔羊的特征是高油酸含量和低动脉粥样硬化指数（AI），而阿卡拉曼羊羔羊则表现出升高的α-亚麻酸水平。基维茨克羊羔羊的DGAT1和IGF1信使核糖核酸（mRNA）水平最高，但蛋白质丰度呈现相反的模式。美利奴羊羔羊表现出最高的DGAT1和IGF1蛋白水平，而基维茨克羊羔羊的DGAT1蛋白水平最低，且与阿卡拉曼羊相比，其FABP4蛋白丰度显著降低，尽管FABP4的mRNA水平无显著差异。这些差异指向强烈的品种特异性转录后调控。PPI和富集分析进一步表明，DGAT1、FABP4和IGF1作用于包含过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）、脂肪酸合酶（FASN）、硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD）及相关节点的更广泛调控模块内，通过过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）和胰岛素相关信号通路协调能量稳态。这些发现表明，所研究品种之间的差异既反映在肌肉脂肪酸谱上，也反映在脂质相关基因的表达模式及其相互作用网络上。DGAT1、FABP4和IGF1，连同所鉴定的以脂质为中心的PPI模块，可能作为有前景的分子候选标记，用于旨在改善脂肪酸组成及其营养脂质价值的品种特异性选择策略。

一、研究背景与目的

羊肉生产是全球畜牧业的关键组成部分。不同绵羊品种因遗传背景和尾部形态（如肥尾与薄尾）的差异，其脂肪沉积模式和肌肉脂肪酸组成可能存在显著不同。然而，关于不同尾部形态绵羊品种的骨骼肌脂肪酸组成与关键脂质代谢及生长相关基因表达之间关系的研究尚不充分。特别是，二酰基甘油酰基转移酶1（DGAT1）、脂肪酸结合蛋白4（FABP4）和胰岛素样生长因子1（IGF1）这三个基因在调节脂质代谢、脂肪沉积和生产性状中扮演重要角色，但在不同尾部形态绵羊品种中，它们与骨骼肌脂肪酸组成的关联及相应的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络特征仍未得到充分阐明。因此，研究人员提出假设：所研究的绵羊品种会表现出与DGAT1、FABP4和IGF1差异性的mRNA和蛋白表达模式相关的独特骨骼肌脂肪酸谱。为了验证这一假设，研究人员对美利奴羊（短、薄尾型）、阿卡拉曼羊（肥尾型）和基维茨克羊（长、薄尾型）三个品种进行了评估，以确定它们在肌肉脂肪酸组成、基因和蛋白表达以及PPI网络特性方面的差异。该研究成果发表于《Journal of Food Quality》。

二、主要技术方法

1. 1.
   实验动物与设计：研究使用了来自土耳其安纳托利亚中部地区一个商业农场的18只雄性羔羊，分为美利奴羊、阿卡拉曼羊和基维茨克羊三组，每组6只。所有羔羊在约2月龄时开始为期90天的育肥期，饲喂相同的商业化精料和干草，达到目标屠宰体重（35-40 kg）后进行屠宰。
2. 2.
   脂肪酸分析：采集臀中肌组织样本。采用Bligh和Dyer方法提取总脂，经甲酯化后，使用配备Restek毛细管柱的气相色谱-质谱联用（GC-MS）系统进行脂肪酸谱分析，并以占总脂肪酸的百分比表示各脂肪酸含量。
3. 3.
   基因表达分析：使用Trizol试剂提取总RNA，经DNase I处理后，利用高容量cDNA反转录试剂盒合成cDNA。采用SYBR Green实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术，以GAPDH为内参基因，通过2^-ΔΔCt方法计算DGAT1、FABP4和IGF1的相对mRNA表达量。
4. 4.
   蛋白表达分析：使用补充了蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取总蛋白，通过BCA法测定浓度。采用蛋白质印迹法（Western blot）检测DGAT1、FABP4和IGF1的蛋白丰度，以ACTB为内参，并使用ImageJ软件进行条带定量。
5. 5.
   生物信息学分析：利用STRING数据库对差异表达的DGAT1、FABP4和IGF1蛋白进行PPI网络分析，仅纳入置信度评分大于0.400的相互作用，并使用Cytoscape软件进行可视化。随后，利用STRING富集工具进行功能富集分析，包括基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）/Reactome通路分析，以错误发现率（FDR）小于0.01为显著性阈值。

三、研究结果

• •
  3.1. 脂肪酸谱：研究发现，阿卡拉曼羊和基维茨克羊的癸酸（C10:0）浓度高于美利奴羊。美利奴羊的月桂酸（C12:0）浓度高于基维茨克羊。美利奴羊和阿卡拉曼羊的肉豆蔻酸（C14:0）和十五烷酸（C15:0）水平均高于基维茨克羊。阿卡拉曼羊的棕榈油酸（C16:1）浓度高于其他两个品种。基维茨克羊的十七碳烯酸（C17:1）水平低于其他品种。基维茨克羊的油酸（C18:1n9）浓度显著高于美利奴羊和阿卡拉曼羊。美利奴羊和阿卡拉曼羊的亚油酸（C18:2n6）浓度高于基维茨克羊。二十碳烯酸（C20:1）、α-亚麻酸（C18:3n3）和二十三碳酸（C23:0）在阿卡拉曼羊中最高，基维茨克羊最低。美利奴羊的二十碳五烯酸（EPA, C20:5n3）浓度高于其他两者，而阿卡拉曼羊和基维茨克羊的二十二碳六烯酸（DHA, C22:6n3）浓度高于美利奴羊。
• •
  3.2. 营养指标：基维茨克羊具有更高的单不饱和脂肪酸（MUFA）总和，但多不饱和脂肪酸（PUFA）总和较低。相应地，美利奴羊和阿卡拉曼羊的PUFA/SFA（饱和脂肪酸）比值更高，而基维茨克羊最低。阿卡拉曼羊的总n-3脂肪酸含量最高。此外，基维茨克羊的动脉粥样硬化指数（AI）显著低于美利奴羊。
• •
  3.3. 基因表达：基维茨克羊的DGAT1 mRNA表达水平显著上调，约为美利奴羊和阿卡拉曼羊的2倍。FABP4的mRNA水平在各品种间无显著差异。基维茨克羊的IGF1 mRNA表达水平显著升高，超过阿卡拉曼羊和美利奴羊的2倍。
• •
  3.4. 蛋白表达：DGAT1蛋白水平在美利奴羊中最高，约为阿卡拉曼羊和基维茨克羊的2倍，且基维茨克羊的DGAT1蛋白水平低于阿卡拉曼羊。FABP4蛋白丰度在基维茨克羊中显著低于阿卡拉曼羊。IGF1蛋白丰度在美利奴羊中最高，比阿卡拉曼羊和基维茨克羊高出约1.5倍。
• •
  3.5. PPI网络分析：围绕DGAT1、IGF1和FABP3构建的相互作用网络包含43个节点和429条边。中心节点包括关键的脂肪组织代谢调节因子，如固醇调节元件结合蛋白1（SREBF1）、过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARA）和γ（PPARG）、脂肪酸合酶（FASN）、乙酰辅酶A羧化酶α（ACACA）、硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD）、含patatin样磷脂酶结构域蛋白2（PNPLA2）、脂素-1（LPIN1）、脂滴包被蛋白1（PLIN1）和2（PLIN2）。此外，与产热和能量稳态相关的蛋白（如解偶联蛋白1（UCP1）和2（UCP2））以及与胰岛素敏感性和内分泌代谢调节相关的基因（如溶质载体家族2成员4（SLC2A4, GLUT4）和瘦素（LEP））也与这些中心节点形成强功能关联。
• •
  3.6. 功能富集分析：GO分析显示，网络蛋白显著富集于脂肪酸代谢过程、甘油三酯代谢过程、脂质生物合成和分解过程等生物学过程，以及长链脂肪酸结合和甘油三酯脂肪酶活性等分子功能。细胞组分富集于脂滴。KEGG和Reactome通路分析揭示了在PPAR、AMP活化蛋白激酶（AMPK）、胰岛素和脂肪细胞因子信号级联等主要能量代谢调控通路中的显著富集。

四、讨论与结论

讨论部分指出，基维茨克羊较高的油酸和MUFA含量以及较低的AI值，暗示其具有更有利于心血管健康的脂质谱。阿卡拉曼羊较高的α-亚麻酸和n-3含量以及更优的PUFA/SFA比率也具有积极的营养学意义。研究中观察到的mRNA与蛋白水平不一致的现象（尤其在DGAT1和IGF1中）强调了转录后调控的重要性，表明仅依靠基因表达数据可能产生误导，在育种选择中应同时评估蛋白水平。DGAT1和FABP4在mRNA与蛋白水平的反向趋势可能涉及微小RNA（miRNA）介导的翻译抑制或差异性的翻译效率及蛋白稳定性。PPI网络分析揭示了这些差异表达蛋白与PPARG、FASN、SCD等脂质代谢核心调控因子的紧密联系，功能富集分析也证实了它们参与PPAR、AMPK和胰岛素等信号通路，这共同表明了品种间差异与更广泛的脂质调控过程相关联。

研究结论：本研究表明，三个绵羊品种在臀中肌脂肪酸组成以及DGAT1、FABP4和IGF1在转录本和蛋白水平的表达模式上存在差异。尽管所有品种的PUFA/SFA和n-6/n-3比值均保持在营养学推荐范围内，但观察到的差异表明每个品种可能具有独特的肌肉脂质谱。mRNA和蛋白水平之间的差异表明，在育种和选择研究中，仅凭转录本水平的数据来评估这些候选标记可能是不够的。此外，PPI和富集分析显示，DGAT1、FABP4和IGF1与涉及PPARG、FASN和SCD的更广泛的脂质相关调控网络相连。这些发现表明，DGAT1、FABP4和IGF1，连同它们的相互作用蛋白，可能成为针对改善脂肪酸组成和营养脂质价值的选择策略的有用分子候选标记。