无麸质意大利面加工过程中黄曲霉毒素和伏马菌素的命运：基于非靶向13C标记LC-HRMS的方法

《JOURNAL OF MASS SPECTROMETRY》：Fate of Aflatoxins and Fumonisins During Gluten-Free Pasta Processing: Untargeted 13C-Labelling LC-HRMS Based Approach

　　

基于以往经验和当前认知，研究人员推测，污染原料的真菌毒素（mycotoxins）在食品加工过程中因暴露于热和机械条件可能被降解或修饰，从而产生降解和/或转化产物。目前，关于真菌毒素新型降解产物的大部分信息仍然缺失；对其结构的鉴定和表征及其毒性潜力对于风险评估策略具有重要意义。本研究考察了以玉米粉为原料生产无麸质意大利面过程中黄曲霉毒素（aflatoxins, AFs）和伏马菌素（fumonisins, FBs）的命运。研究人员使用加标面团和自然污染面粉生产无麸质意大利面，在中试工厂条件下模拟工业条件进行加工，获得了技术可行的产品。采用非靶向稳定同位素标记液相色谱-高分辨质谱（untargeted stable isotope labelling liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry, SIL LC-HRMS）方法鉴定了加标真菌毒素可能产生的降解产物。在实验装置的检测限以上，未检测到黄曲霉毒素B₁（AFB₁）的降解产物，仅发现一种可能为伏马菌素B₁（FB₁）或B₂（FB₂）的降解产物，且含量极低。结果表明，在无麸质意大利面生产条件下，这些真菌毒素可能具有稳定性。

本研究发表于《JOURNAL OF MASS SPECTROMETRY》，旨在探究无麸质意大利面加工过程中黄曲霉毒素和伏马菌素的命运。背景方面，意大利面在全球广泛消费，传统产品以硬质小麦为原料并含麸质，但近年来因乳糜泻或麸质不耐受而选择无麸质食品的人群不断增加，推动全球无麸质产品市场快速扩张。无麸质意大利面常以玉米或大米为原料，而这些谷物易受黄曲霉毒素（AFs）和B族伏马菌素（FBs）污染，对消费者健康构成威胁。欧盟规定玉米粉中AFB₁限量为2 μg/kg，FB₁与FB₂之和限量为1000 μg/kg。目前常规监测主要针对游离形式真菌毒素，但加工过程中热和机械作用可能导致毒素降解或修饰，形成常规方法难以检出的新型产物。这些产物的毒性和暴露风险尚不明确，因此识别和表征降解产物对完善风险评估策略至关重要。

研究人员在中试工厂条件下，以加标和自然污染玉米粉为原料生产技术可行的无麸质意大利面（lasagne和maccheroni），采用非靶向稳定同位素标记（SIL）结合液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）技术追踪AFB₁、FB₁和FB₂的降解或转化产物，并通过LC-MS/MS进行定量验证。

关键方法包括：使用来自意大利供应商的合规玉米粉进行加标实验，以及来自高度污染田块的自然污染玉米粒制备面粉。加标样品分别添加非标记和均匀¹³C标记的AFB₁及FB₁/FB₂标准品。意大利面制作流程包括加水混合至水分含量65%，真空密封后于85°C水浴加热至面团温度75°C，擀制成lasagne薄片，在干燥室中干燥（最高80°C，360分钟），再在含7 g/L NaCl沸水中煮7分钟；自然污染面粉还通过挤压机制备maccheroni。样品在多个加工步骤采集，经提取后进行LC-HRMS全扫描分析，利用MetExtract II软件识别非标记与¹³C标记同位素对特征，以发现潜在转化产物。

研究结果分为以下几个部分：

**3.1 非靶向示踪研究（AFB₁及FB₁/FB₂）**

**3.1.1 对照实验**：通过合规玉米粉优化生产流程，所得干燥lasagne片水分含量为10.8%，符合法定限值（<12.5%）。合规玉米粉中天然毒素水平为AFB₁ 1.95 μg/kg、FB₁ 625 μg/kg、FB₂ 148 μg/kg。

**3.1.2 AFB₁的命运**：在五个加工步骤的样品中，均未检测到AFB₁的降解或转化产物。LC-MS/MS定量显示，AFB₁浓度在各加工阶段变化很小，剩余差异可归因于基质效应、不同样品的含水量及分析样本量较小。这表明AFB₁在无麸质意大利面生产条件下基本稳定。

**3.1.3 FB₁和FB₂的命运**：检测到三个fumonisin衍生代谢物。代谢物1和2均含有原34个碳原子中的28个，但它们也存在于非标记和¹³C标记标准品以及原料玉米粉中，因此很可能是标准品和原料中的污染物，而非加工转化产物。代谢物3（m/z 868.4533）在非标记标准品中存在，但在¹³C标记标准品和原料中不存在；该代谢物在干燥意大利面的两个重复样品和煮制样品的一个重复中极低水平检出，提示其可能由标记前体在加工过程中形成。然而，其同位素模式不符合质量判定标准（非标记侧仅见M和M+1，标记侧仅见M'、M'-1和M'-2，缺少预期的镜像模式），因此未能被确认为有效的伏马菌素衍生化合物。

**3.2 自然污染玉米粉制意大利面中伏马菌素衍生代谢物的验证**：以自然污染玉米粉（AFB₁ 74.9 μg/kg、FB₁ 708 μg/kg、FB₂ 146 μg/kg）生产lasagne和maccheroni，所有生产步骤均检出代谢物1和2；代谢物3仅在干燥maccheroni样品中极低水平检出，在干燥lasagne或其余样品中未检出。这一结果支持代谢物3可能形成于干燥阶段，但其浓度太低且未达到确认标准。

讨论部分指出，AFB₁未检出降解产物，与文献中黄曲霉毒素在多种条件下高度稳定的报道一致。FBs通常具有热稳定性，但稳定性受具体加工条件影响显著。本研究中唯一被检出的可能代谢物可能形成于干燥步骤，但因同位素模式不合格及浓度极低，未作进一步表征。结论部分总结：在无麸质意大利面生产的中试工厂条件下，未检测到超过方法检测限的AFB₁降解或转化产物；对于FB₁和FB₂，仅检测到一个极低强度的代谢物，但未达到质量确认标准，因此未能确认为降解产物。这些发现表明这些真菌毒素在此加工条件下具有较高稳定性，但应结合所用方法学的灵敏度局限来理解，不能排除低于检测限或分析范围之外的转化产物形成的可能性。