全小鼠心脏细胞尺度细胞构筑的高通量、高保真三维重建

《The Journal of Physiology》：High-throughput, high-fidelity reconstruction of whole mouse-heart cytoarchitecture at cellular scale

　　

理解心肌三维组织结构需要能够在整个心脏尺度分辨细胞结构成像方法。现有方法在空间分辨率、成像深度与通量之间存在权衡。研究人员提出一种用于全小鼠心脏高保真重建的高通量成像流程。该方法结合针对心脏组织优化的CUBIC组织透明化方案、双相机选择性平面照明显微镜（dual-cesoSPIM，dual-mesoSPIM）以及从对向探测视图中选择最高对比度信息的自动融合算法。研究人员以无标记方式（利用心肌自体荧光）对全心脏（n=9）进行成像，体素大小为3.25×3.25×3 μm3，每个样本约25分钟。双视图融合相较单相机采集显著减少深度依赖的信息丢失，从而实现心室壁中心肌细胞（cardiomyocyte，CM）方向与薄层（sheetlet）组织结构的稳健三维重建与形态测量。对纤维与薄层方向的定量形态测量证实了预期的心肌跨壁组织方式，包括螺旋角（helix angle）的渐进旋转以及薄层结构的区域变异。该方案兼容内源性荧光报告基因与全器官染色，例如可重建完整小鼠器官内的心脏交感神经系统。新流程为生理与病理模型中心脏细胞构筑的中尺度（mesoscale）绘图提供快速、可扩展策略。

研究背景方面，心脏架构由心肌层、小梁、冠状与淋巴血管、心内神经及细胞外基质等构成，对心功能与生理及病理适应具有根本作用。心肌由心肌细胞组成薄层片结构，具有明确的跨壁螺旋状局部优势细胞方向，即所谓“纤维”方向，是电传导与机械收缩的核心。现有超声缺乏单细胞分辨率，扩散张量磁共振成像（diffusion tensor magnetic resonance imaging，DTI）受限于分辨率、信噪比与长时间采集，X射线类方法可及性差且难兼容多重染色，机械切片类方法破坏组织完整性并引入伪影。光学组织透明化结合光片显微镜是重要替代，但心脏因致密细胞内外纤维与脂膜室带来透明化挑战，SHIELD需3至5个月，CLARITY可达6个月并改变宏观形态；中尺度选择性平面照明显微镜（mesoscale selective plane-illumination microscopy，mesoSPIM）可快速体成像，但深度散射使细胞尺度结构丢失。因此研究人员开展本研究，旨在建立快速、高保真、全心脏细胞尺度重构流程。

该论文发表于《The Journal of Physiology》。研究人员将心脏适配CUBIC透明化、双相机mesoSPIM与自动融合结合，实现无标记全小鼠心脏细胞构筑重建，并用酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）免疫荧光示踪心脏交感神经系统，证明流程兼容内源荧光与全器官免疫染色。其意义在于为生理及病理模型中心脏细胞构筑与神经重塑的中尺度绘图提供可扩展方案。

主要关键技术方法方面，样本包括13只成年CTRL小鼠（9只全心脏自体荧光、3只TH免疫荧光、1只切片）、R26R-Confetti新生小鼠经AAV9-CyB-Cre处理、3只CD1小鼠做初步组织学。核心方法为CUBIC-L脱脂与CUBIC-R+(N)折射率匹配、双相机mesoSPIM采集、基于二维傅里叶谱高频能量比的对比度驱动双视图融合、结构张量分析（structure tensor analysis，STA）估计心肌细胞与薄层方向、Laplace–Dirichlet规则法建立心室参照系并算螺旋角/跨壁倾角/薄层角、Helmholtz滤波分离宏观纤维场与高频残差、Trainable Weka 3D机器学习分割TH纤维。

Whole-heart optical clearing and dual-mesoSPIM imaging：研究人员对12只成年小鼠心做CUBIC透明化，全流程约5周；心室轮廓面积清除前后无显著差异，苏木精-伊红（haematoxylin and eosin，H&E）切片显示细胞构筑保存。双mesoSPIM两对向激发臂与两sCMOS相机，视场10.4×10.4 mm²，轴分辨率约12 μm；无标记自体荧光638 nm激发，每心约25分钟，对向相机互补抵消深度散射。

3-D reconstruction of cardiomyocyte cytoarchitecture at whole-heart scale：研究人员用单相机中FA（fractional anisotropy，分数各向异性）<0.25作为不可分析指标，单相机不可分析体积约18.4%与22.6%，融合后降至10.3%；融合流程以10%空间频率截止对比度比过零点定Z_switch，刚体配准后拼接，全心室纤维流线显示跨壁方向可辨。

Ventricular morphometry of cardiomyocyte and sheetlet orientation：在融合可分析体积>95%的5只心中，螺旋角分布最广并跨壁由负转正，跨壁倾角围绕0，薄层角变异性大于螺旋角但小于全跨壁旋转；左室游离壁核心区螺旋角随跨壁坐标λ_TM近似单调变化，证实预期心肌架构。

Compatibility of the CUBIC protocol with endogenous fluorescent reporters：Confetti 300 μm切片14天透明，折射率匹配后面积扩约49%；RFP与GFP信号强度下降、背景上升、信背比（signal-to-background ratio，SBR）降低，核GFP小结构较胞质RFP更易丢失，但报告基因荧光在清除后仍可判识。

Whole-heart 3-D reconstruction of the cardiac sympathetic nervous system：3只CTRL心做TH免疫染色与双mesoSPIM重建，随机森林分割出轴突与沿冠脉束状神经；虚拟切片、同heart物理切片、另heart切片后染色三者均见室间隔神经密度低于游离壁，全心脏制备有更陡跨壁梯度，说明抗体扩散限制但CUBIC仍支持全器官微米神经终端成像。

讨论部分总结：CUBIC约5周即可获足够透明且大体形变小，薄片面扩张被厚度缩减补偿而非真体积增加，全心脏几何抑制三维变形；相较SHIELD与CLARITY更实用。双相机融合把深度散射导致不可分析体积几乎减半，使无标记细胞构筑与免疫标记神经成像兼得。TH结果显示扩散限制确实存在，但全mount染色已能绘全心交感网络。内源荧光虽SBR下降仍可用于转基因模型。该平台兼顾通量、分辨率与可扩展性。

研究结论部分翻译：研究人员呈现一种稳健、高通量成像方案，用无标记方式重建全小鼠心脏心肌细胞架构；心脏适配CUBIC透明化加双mesoSPIM与自动后处理，使对向探测互补、基于高频含量分析融合最高对比度图像。流程以心肌自体荧光验证局部优势三维方向，双相机显著降低深度散射造成的信息丢失，并兼容内源荧光报告基因与全心脏免疫染色，可重建完整器官内心脏神经系统。该管线为健康与疾病中心脏细胞构筑及其重塑制图提供快速可扩展中尺度策略。