基于核酸信号放大策略结合 DNA 修饰磁性纳米传感器的霉菌毒素双重检测

《Microchemical Journal》：Dual-detection of mycotoxins based on nucleic acid signal amplification strategies combined with DNA-modified magnetic nanosensors

　　

• 开发了一种His-Fe?O?@DNA纳米传感器，用于霉菌毒素的捕获、转化和增强检测。• 适配体整合了霉菌毒素检测与核酸信号放大策略。• 检测信号通过不同的信号放大策略进行放大。• 输出的荧光信号以"开启"模式呈现。• 人工感染实验证明了所开发方法的可靠性。

**引言**

霉菌毒素作为一种有毒的次级代谢产物，可由多种产毒真菌在适宜环境下产生。由于其广泛存在，霉菌毒素已成为食品中不可避免的天然生物污染物，无法完全消除[1]。一旦摄入，受霉菌毒素污染的食物可能导致人类急性或慢性健康问题，包括各种癌症、消化系统障碍、肝脏疾病、出血综合征，以及影响免疫和神经系统的疾病[2]、[3]、[4]。因此，为防止霉菌毒素中毒、保障食品安全和维护公共卫生，开发能够灵敏可靠地检测霉菌毒素的分析方法至关重要[5]、[6]。然而，目前大多数检测方法仅限于识别单一类型的霉菌毒素，这严重限制了其在多种霉菌毒素频繁共存的复杂污染场景中的适用性[7]、[8]。

迄今为止，已鉴定出超过500种霉菌毒素。其中，大量已确认在谷物和谷物衍生物中共存[9]、[10]。这种共存可能归因于单一种宿主被多种产毒真菌同时感染，或单一真菌物种能够产生多种霉菌毒素[11]、[12]。目前研究表明，食品中常见的霉菌毒素包括黄曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉酮（ZEN）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、赭曲霉毒素A（OTA）、伏马毒素B1（FB1）和T-2毒素（T-2）[13]、[14]。这些霉菌毒素被发现存在多达22种不同的共存模式，单一基质中可能有高达7种霉菌毒素共存[15]、[16]、[17]。这些霉菌毒素的共存可能导致复杂的协同效应，从而增加其整体毒性，即使在相对较低的浓度下也会对人类和动物健康构成更大风险[18]、[19]。AFB1和OTA在低浓度下可表现出协同效应，显著改变基因表达，造成DNA损伤和细胞死亡，从而导致免疫毒性[20]。在低浓度下，ZEN对AFB1引起的肝毒性和细胞毒性具有双重作用，在较低浓度下减轻细胞损伤，而在较高浓度下增强毒性[21]。这些研究表明，即使单个霉菌毒素的含量在法规安全限值之内，其共存仍可能对生物系统产生显著不利影响[22]、[23]。因此，仅检测单一霉菌毒素已不足以进行全面的食品安全分析，这凸显了开发能够同时检测多种霉菌毒素的方法的紧迫必要性。

传统的多组分检测方法，如高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS），以其高精度和同时检测多种霉菌毒素的能力而闻名。然而，这些技术涉及复杂的操作步骤，要求分析前进行严格的样品纯化，且灵敏度有限，从而限制了其在大批量样品快速现场筛查中的有效性[24]。为克服这些局限性，多种纳米材料（包括金纳米颗粒、碳纳米管和纳米酶等）已与抗体、适配体和分子印迹聚合物等生物识别元件相结合。该方法已被证明具有显著的性能优势，包括高灵敏度、快速响应、多靶标检测能力和强便携性[25]。因此，已开发出各种灵敏的分析方法来同时检测不同的霉菌毒素，包括化学发光[26]、比色测定[27]、纸基层析免疫分析[28]、电化学传感技术[29]和基于适配体的生物传感器技术[30]。在这些方法中，基于适配体的生物传感器使用适配体作为生物识别元件，并与不同的光学检测技术（如荧光方法、比色法和表面增强拉曼散射）相结合，从而显著提高霉菌毒素检测的准确性和灵敏度。磁性纳米颗粒的引入可通过磁性分离策略进一步增强信号放大效率并降低检测背景噪声，从而在光学和电化学系统等不同检测平台中发挥关键作用[31]。在这些光学检测技术中，基于荧光的方法通过不同的荧光探针产生检测信号，并在多样性、水溶性和生物相容性方面具有显著优势[32]。这些特性赋予了其高灵敏度和多重分析能力，使其得到广泛应用[33]、[34]。然而，传统的荧光检测策略通常以"关闭"模式运行，通过采用淬灭剂来抑制探针的荧光信号以实现目标分析物的灵敏检测[35]。这种方法往往导致较高的背景信号，从而降低检测灵敏度并增加荧光团的消耗。为克服这些局限性，研究人员采用了"开启"模式来调控荧光信号的变化。该方法避免了淬灭剂的使用，简化了荧光探针的修饰和纯化程序，从而提高了检测灵敏度[36]、[37]。

G-四链体是一种富含鸟嘌呤的核酸序列，在K?或Na?存在下可形成独特的二级结构。这种独特的结构构象使其能够选择性结合特定的荧光染料，如硫黄素T（ThT），导致荧光信号显著增强。这一特性使G-四链体能够通过"开启"模式调控荧光信号的强度，从而为生物传感器的发展提供了巨大的潜力[38]、[39]。2-氨基嘌呤（2-AP）是腺嘌呤的荧光类似物，在游离状态下表现出强荧光。然而，当它被插入核酸序列的双链区域时，碱基堆积作用可显著降低其荧光强度[40]。因此，通过将2-AP插入DNA发夹结构中，并通过特定的核酸反应控制双链DNA（dsDNA）与单链DNA（ssDNA）之间的转换，可以实现对抗生素和重金属等目标污染物的有效检测，且无需额外的荧光淬灭剂[41]、[42]。鉴于上述荧光信号均由基于核酸序列的反应触发，这些反应可以有效地与核酸信号放大策略相结合。这种整合促进了大量特异性核酸结构的形成，从而增强了检测信号的强度并显著提高了检测性能。在常用的核酸信号放大技术中，DNAzyme辅助的循环切割策略和杂交链式反应（HCR）均表现出高效的放大效率，并被广泛应用。作为人工合成的功能性核酸序列，DNAzyme能够特异性杂交与目标核酸序列，并在特定金属离子的催化下精确切割指定位点[43]。例如，当核糖核苷酸（rA）被掺入底物链时，一种依赖于Zn2?的DNAzyme可以在Zn2?存在下特异性识别该位点并进行切割。值得注意的是，每次切割事件后，片段化的底物会从DNAzyme上解离，使游离的DNAzyme能够重新结合完整的底物链并介导新一轮切割。这种循环切割反应使单个DNAzyme能够催化多个底物链的切割，从而实现显著的信号放大[44]。该切割反应可诱导核酸序列的结构变化，从而实现特定荧光信号的"开-关"切换，促进其在分析检测领域的广泛应用[45]、[46]、[47]。HCR是一种可编程的等温核酸放大技术，能够在无需酶和热循环的情况下实现信号放大。在HCR反应中，特异性触发序列依次激活不同的预设计DNA发夹结构，触发构象展开和随后的延伸dsDNA结构的组装。这些DNA发夹被设计为维持亚稳态构象。首先，触发序列结合第一个发夹末端暴露的区域，打开其发夹结构以暴露新的功能性序列。新暴露的序列随后通过相同机制与下一个发夹杂交，触发第二个发夹的展开。这种级联放大反应在两种类型的发夹结构之间交替重复，最终组装成延伸的缺口dsDNA聚合物。值得注意的是，每个触发序列可启动数百至数千个发夹结构的组装，产生显著的信号放大[48]。通过设计具有特定序列的发夹结构，可将多个重复的二级结构（如G-四链体）纳入最终的dsDNA结构中，从而利用其独特的结构特性显著增强检测信号[49]、[50]。基于这些技术，设计特定的适配体并将其应用于识别和捕获非核酸靶标，从而将非核酸靶标的检测转化为相应核酸序列的识别。随后，通过将核酸信号放大策略与高效荧光信号源的激活相结合，可以有效地实现非核酸目标物质的高灵敏检测。

在本研究中，开发了一种基于两种核酸信号放大技术的荧光检测方法，用于ZEN和AFB1的双重检测。采用磁珠作为固相载体，并将其表面固定特设计的dsDNA结构以构建纳米传感器。这些dsDNA结构包含能够选择性识别和捕获目标霉菌毒素的适配体。在捕获反应后，与适配体互补的ssDNA序列被激活，随后启动DNAzyme辅助的切割反应和HCR过程。DNAzyme特异性地将含有双链区域内2-AP的发夹结构切割成两条单链片段。该反应促进了2-AP荧光信号的恢复，从而实现了对玉米赤霉酮的定量检测。同时，由于发夹结构的具体设计，在HCR过程中生成了含有多个G-四链体的延伸dsDNA结构，显著增强了ThT的荧光信号，从而实现了对AFB1的高灵敏检测。在整个检测过程中，荧光信号以"开启"模式产生，无需外部淬灭剂，核酸反应的放大能力进一步提高了方法的灵敏度。该方法的可靠性通过使用自然污染和人工接种的谷物样品进行了验证。

**部分摘要**

**试剂与化学品**

AFB1、ZEN、DON、OTA和T-2购自 J&K Scientific（中国上海）。乙二醇（EG）、甲醇、L-组氨酸（His）、ThT和氯化锌（ZnCl）购自麦克林生化科技有限公司（中国上海）。三氯化铁六水合物（FeCl?·6H?O）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）购自 Sigma-Aldrich LLC（中国上海）。阳性样品（玉米粉、玉米胚芽粉和……

**检测原理**

所开发方法的检测机制如图1所示。预合成的dsDNA结构（DNAzyme/ZEN-aptamer和cDNA/AFB1-aptamer）通过酰胺键的形成固定在His-Fe?O?纳米颗粒表面，构建His-Fe?O?@DNA纳米传感器。该分析策略包含两个关键过程：DNAzyme辅助的循环切割和HCR。当引入含有AFB1和ZEN的分析样品时，各自的适配体选择性地识别并捕获其……

**结论**

在本研究中，成功开发了一种基于荧光的纳米传感器，用于谷物及谷物衍生物中两种霉菌毒素（ZEN和AFB1）的同时检测。固定在磁性纳米材料上的适配体促进了对相应霉菌毒素的精确识别，导致触发链的释放以启动后续的放大反应。不同的检测信号分别通过DNAzyme辅助的循环切割和HCR进行放大……

**CRediT作者贡献声明**

沈卓月：撰写——初稿，形式分析。居家河：形式分析。苏秀清：形式分析。井杨通：形式分析。牛淑杰：形式分析。李世杰：撰写——审阅与编辑，资金获取。朱江：资金获取，形式分析。蓝杭振：形式分析。孔德昭：撰写——审阅与编辑，资金获取，概念化。刘畅：资金获取，形式分析。

唐生：撰写—审阅与编辑、监督指导

利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢
作者感谢国家自然科学基金委员会（项目编号：22574067、22406069和32001804）、JUST新兴科技与创新团队基金（项目编号：1182921902）、江苏省研究生科研与实践创新计划（KYCX24_4171）、江苏省市场监督管理局科技计划项目（KJ2026101）以及扬州市科技计划项目的资助。

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