综述：环境毒理学中标记化合物用于靶点鉴定的应用

《Microchemical Journal》：Applications of Labeled compounds for target identification in environmental toxicology

　　

荧光、光亲和和生物素探针使化学靶标鉴定成为可能。
多组学整合促进了对生物相关靶标的优先级排序。
基于人工智能的蛋白质结合位点预测加速了化学靶标的发现。
化学标记策略为机制性分子毒理学提供了强大工具。

引言

截至2024年5月，《有毒物质控制法》化学物质清单包含86,770种化学物质，其中42,377种在美国商业中处于活跃使用状态。这些合成化学品广泛应用于工业、农业和医药等领域，对现代社会的进步做出了重大贡献[1]。然而，在化学品的生产、使用和排放过程中，作为潜在环境污染物的化学品会进入空气、水和土壤[2]，并可能最终通过食物链或皮肤接触等途径进入人体[3]。据估计，全球每年约有九百万人死亡归因于空气、水和土壤污染[4]。证据表明，这些化学品可能与关键生物大分子（如核酸或代谢物[5]、蛋白质[5]和脂质）发生相互作用，从而破坏正常的生理功能并引发健康问题，包括癌症、神经退行性疾病及其他疾病[6,7,8,9]。在不良结局通路框架内，初始的化学-生物分子相互作用可构成分子起始事件，该事件可能通过一系列可测量的关键事件进行传播，并最终导致与人类或生态风险评估相关的不良结局[10]。因此，确定有机污染物的直接分子靶标对于阐明其毒理学机制至关重要。

与实验靶标鉴定方法并行发展的，分子模拟已成为研究污染物行为和分子相互作用的重要计算策略。分子对接可以预测合理的结合构象和相互作用位点，而分子动力学模拟可以进一步评估污染物-生物分子相互作用的稳定性和构象动态特征。蒙特卡洛模拟和自由能计算可以提供分子缔合和结合偏好的热力学信息，而量子力学方法，特别是密度泛函理论，可以表征电子结构、分子反应性和特定的分子间相互作用。最近的研究表明，MD、MC、DFT和相关计算方法在获得环境污染物相互作用的原子和分子层面洞察以及补充实验研究方面具有越来越高的价值[11,12,13]。在基于标记的靶标鉴定背景下，这些方法可以提供互补的计算机模拟框架，用于筛选候选污染物-靶标相互作用、预测结合构象并指导探针合成和实验验证前的理性探针设计，从而减少实验成本并提高机制解释能力。

然而，由于生物系统的复杂性以及有机污染物通常与多个分子靶标而非单一靶标相互作用，识别这些靶标仍然是一个重大挑战[5]。因此，迫切需要一种能够全面揭示有机污染物多个分子靶标的靶标鉴定方法。过去几十年中，开发了几种无偏见的系统性方法用于鉴定有机污染物的靶标，如全转录组化合物特征谱分析[14,15]和化学基因组学方法[16]。然而，这些方法无法直接确认化合物与其假定分子靶标之间的结合。为了解决这一局限，近年来分子生物学和基因组后时代的进展使得化学蛋白质组学得到越来越广泛的应用，特别是与质谱联用的标记技术用于污染物高通量直接蛋白质靶标鉴定[5,17]。除了鉴定蛋白质，荧光标记策略还可以实现化合物与靶标蛋白质的共定位。此外，标记技术与高通量测序等下游检测方法相结合，已实现了核酸等多种分子靶标的鉴定。

化学蛋白质组学是蛋白质组学的一个重要分支，是合成化学、细胞生物学和质谱学的交叉融合。它主要包括四个关键步骤：探针设计、探针合成、靶标富集或降解以及靶标鉴定。在探针设计和合成阶段，常见的标记策略包括珠子固定[18]、生物素标记[19,20]、光亲和标记[21,22]、荧光标记[23,24]以及基于诱导蛋白质降解的探针。这些方法为捕获和表征小分子直接分子靶标提供了强有力的手段，并且越来越广泛应用于环境毒理学[17]。然而，大多数这些标记策略最初是在药物发现和化学生物学领域开发和广泛优化的，而它们对环境污染物的应用仍然相对有限。

这一区别很重要，因为环境污染物与理性设计的药物配体存在根本差异。药物分子通常针对特定靶标和结合性质进行优化，而环境污染物并非基于靶标亲和力或选择性进行选择，因此可能与多个生物分子靶标发生微弱、短暂或多样的相互作用，使得区分特异性相互作用和非特异性结合更加困难[5,25]。此外，许多污染物含有紧凑、疏水或化学惰性的结构，缺少可以在不改变其天然理化性质或生物活性的前提下进行修饰的功能基团。这一挑战在现有环境应用中显而易见。例如，4,5-二氯-2-正辛基-4-异噻唑啉-3-酮（DCOIT）缺乏适合直接固定的功能基团，需要在药效团远端位置引入末端伯胺基以进行亲和富集[18]。类似地，2,2',4,4'-四溴联苯醚（BDE-47）是一种缺乏适合直接亲和富集的活性基团的疏水性有机污染物。因此，引入了一种包含叠氮光交联剂和炔基手柄的双功能探针，随后通过实验证实了修饰后的探针保留了生物活性[26]。这些例子表明，在药物研究中建立的标记策略不能简单地转移到环境污染物上，而必须考虑污染物特定的化学和生物学约束。因此，在本综述中，药物示例主要作为探针设计、富集和靶标验证的方法学先例包含在内，而在可用时则重点介绍环境示例以说明这些策略如何适应污染物靶标鉴定。

在环境毒理学中，确定污染物的直接分子靶标提供了环境暴露与随后通路扰动、细胞功能障碍和不良结局之间的机制联系。因此，靶标鉴定不仅对于确定哪些生物分子与污染物相互作用至关重要，而且对于理解这些相互作用如何导致毒理学效应同样重要。

此前有几篇综述从相关角度讨论了环境毒理学中的蛋白质靶标鉴定和蛋白质组学。Hall等人强调了确定化学污染物物理蛋白质靶标的重要性，并总结了可用于环境毒理学的几种化学蛋白质组学方法[5]。Genereux随后综述了环境毒物影响蛋白质靶标谱的蛋白质组学策略，特别关注了基于活性的蛋白质谱分析、蛋白质足迹分析和蛋白质稳定性谱分析[27]。最近，Wu等人专门关注了热蛋白质组谱分析和机器学习建模在环境毒理学中剖析化学-蛋白质相互作用的应用[28]。与这些先前的综述相比，本综述主要侧重于基于标记化合物的靶标鉴定，系统地讨论了基于珠子、基于生物素、光亲和、荧光和基于降解的策略在探针设计、靶标捕获和富集、验证以及主要局限性方面的内容。此外，我们将讨论范围扩展到蛋白质靶标鉴定之外，涵盖基因组靶标以及标记衍生的靶标与多组学、机器学习和计算预测的整合。因此，本综述旨在提供一个以标记化合物的设计和应用为中心的互补框架，用于环境毒理学中的机制性靶标鉴定。

因此，本综述组织如下。第2节简要介绍了无标记方法研究蛋白质-化合物相互作用，为后续标记技术的讨论提供比较基础。第3节侧重于标记化合物在环境污染物和药物分子靶标鉴定中的原理和应用，涵盖蛋白质和基因组靶标鉴定以及化学-靶标相互作用的原位追踪。第4节讨论标记技术与多组学结合使用机器学习方法的数据集成和分析，并探讨其在污染物靶标发现中的未来应用方向。第5节简要介绍蛋白质-化合物相互作用的预测工具。第6节总结当前挑战并提供这些技术在环境毒理学研究中应用和环境意义的展望。通过这种结构化的讨论，本综述旨在提供一个系统的、以教程为导向的框架，用于理解和应用环境毒理学中基于标记的靶标鉴定技术。通过逐步介绍这些方法的原理、实验流程、代表性应用、验证策略和局限性，本综述还可作为本科生和研究生以及进入这一跨学科领域研究人员易于参考的资料。

章节摘要

无标记方法研究蛋白质-化合物相互作用：多种无标记技术已被广泛用于研究蛋白质-小分子相互作用。这些方法通常依赖于检测蛋白质在配体结合时发生的理化变化，例如热稳定性变化（如细胞热位移测定法和热蛋白质组谱分析）、酶促敏感性变化（如药物亲和力响应靶标稳定性和有限蛋白酶解-质谱法）等。

环境毒理学中标记策略和靶标鉴定的应用：基于标记的靶标鉴定将探针设计与后续的靶标捕获、富集、检测和验证相结合。由于探针的化学结构直接决定了其与前体靶标的相互作用以及下游分析工作流程，因此探针设计和应用在本节中一并讨论。主要策略按其功能模式进行组织，包括珠子固定、生物素标记、光亲和标记等。

标记衍生的靶标、多组学和机器学习的整合用于阐明毒理学机制：第3节描述的基于标记的方法能够识别环境污染物的候选直接分子靶标。然而，仅仅识别结合靶标不足以解释初始分子相互作用如何传播为细胞功能障碍并最终产生不良表型。相反，转录组学、蛋白质组学和代谢组学可以捕获系统范围的生物反应，但通常无法区分初级分子...

蛋白质-化合物相互作用的预测工具：一个互补的计算任务是预测实验验证前的潜在污染物-蛋白质相互作用，包括候选靶标、配体结合口袋和合理的结合模式。这些预测可以减少实验搜索空间并协助探针设计，但它们应被视为假设而非直接结合的证据。因此，其价值取决于后续使用基于标记的或正交的相互作用检测方法的验证。

展望：基于标记化合物的技术已成为环境研究中不可或缺的工具，为追踪污染物命运、鉴定蛋白质靶标以及在分子、细胞和有机体水平阐明毒性机制提供了精确工具。这些进展改变了我们在复杂生物系统内研究污染物-生物分子相互作用的能力，使得化学物质在活细胞中的行为能够被直接和动态地可视化。尽管取得了这些进展，但仍面临重大挑战...

环境意义：标记依赖性靶标鉴定技术在环境毒理学研究中展现了独特优势，因为它们可以通过化学探针直接捕获污染物结合蛋白质，揭示化学物质与细胞组分之间的特定相互作用，并为毒性分子机制提供直接证据。标记依赖性和无标记靶标鉴定方法的整合正在开辟环境毒理学的新途径。这些...

CRediT作者贡献声明：
刘晓莉：撰写原稿。梁晓星：撰写-审阅与编辑，监督指导。杨仁军：撰写-审阅与编辑，监督指导。尹诺雅：监督指导。Francesco Faiola：撰写-审阅与编辑，监督指导。

利益冲突声明：作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢：本研究获得中国科学院战略先导科技专项（项目编号：XDB0750300）和国家自然科学基金（项目编号：22476209和22576225）资助。

作者：刘晓莉 | 梁晓星 | 杨仁军 | 尹诺雅 | Francesco Faiola