《Molecular Immunology》：Papain reproduces the prothrombin-dependent PAR1/PAR4 signalling mechanism of the house dust mite allergen Der p 1
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木瓜蛋白酶在人角质形成细胞中诱导细胞内活性氧（ROS）产生。该响应依赖于凝血酶样蛋白酶谱系。这些非经典谱系刺激PAR1和PAR4。ROS生成还需要表皮生长因子受体（EGFR）信号、ATP受体、Toll样受体（TLR）和瞬时受体电位（TRP）通道。木瓜蛋白酶通过
木瓜蛋白酶在人角质形成细胞中诱导细胞内活性氧（ROS）产生。该响应依赖于凝血酶样蛋白酶谱系。这些非经典谱系刺激PAR1和PAR4。ROS生成还需要表皮生长因子受体（EGFR）信号、ATP受体、Toll样受体（TLR）和瞬时受体电位（TRP）通道。木瓜蛋白酶通过激活内源性蛋白酶网络模拟HDM group 1过敏原。
研究背景方面，木瓜蛋白酶（papain）属于CA clan、C1 family半胱氨酸蛋白酶，来源于番木瓜，广泛用于食品、酿造、洗涤剂、制药和个人护理工业；虽未被国际免疫学会/世界卫生组织正式列为过敏原，但与职业和非职业超敏反应相关。屋尘螨（house dust mite, HDM）group 1过敏原Der p 1、Der f 1、Eur m 1同属木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶超家族，对过敏疾病负担贡献重大。蛋白酶过敏原的酶活性能破坏上皮紧密连接、增加屏障通透性、激活先天上皮反应并招募炎症细胞。Der p 1可作为非经典促凝血酶原酶/凝血酶原转化酶，其诱导的ROS依赖促凝血酶原及PAR1/PAR4。但木瓜蛋白酶与HDM group 1过敏原序列相似度仅“twilight zone”水平，底物结合袋存在差异，且此前缺乏木瓜蛋白酶关联凝血酶依赖PAR1/PAR4信号的证据。因此研究人员假设并检验：木瓜蛋白酶是否重现Der p 1的促凝血酶原依赖性PAR1/PAR4信号，从而判断其作为HDM group 1过敏原替代物的机制合理性。该研究发表于《Molecular Immunology》。
关键技术方法方面，研究人员以人永生化角质形成细胞HaCaT为模型，使用二氢罗丹明123（dihydrorhodamine 123）负荷细胞并在Hanks平衡盐溶液（HBSS）中测定荧光上升速率以量化细胞内ROS；以纯化Der p 1及商品化木瓜蛋白酶为刺激物；采用广谱半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64、Der p 1选择性细胞不渗透抑制剂compound 1、凝血酶抑制剂argatroban与dabigatran、PAR1拮抗剂FR 171113、PAR4拮抗剂ML354、EGFR抑制剂AG 1478、P2X7变构调节剂AZ 10606120、P2Y2拮抗剂AR-C118925XX、ADAM10抑制剂GI254023X、一氧化氮合酶（NOS）抑制剂1400 W、TLR4拮抗剂TAK242、TLR1/2拮抗剂CU-CPT22、TRPV1拮抗剂A784168、TRPV3拮抗剂TRPV3 7a、TRPV4拮抗剂GSK2193874等进行药理学阻断；以乳酸脱氢酶（LDH）释放评估细胞毒性；无外源样本队列，为体外细胞实验。
研究结果部分，3.1节显示木瓜蛋白酶触发凝血酶依赖性细胞内ROS产生：研究人员发现木瓜蛋白酶浓度依赖性地诱导HaCaT细胞ROS，SkQ1抑制该响应且与Der p 1类似；E-64和compound 1抑制蛋白酶依赖的ROS且无明显细胞毒。Argatroban与dabigatran完全抑制响应，说明木瓜蛋白酶直接或间接将凝血酶原转为凝血酶样活性；FR 171113阻断PAR1、ML354阻断PAR4，证明木瓜蛋白酶通过PAR1和PAR4激活，与Der p 1机制一致。
3.2节显示木瓜蛋白酶依赖性细胞内ROS产生需要表皮生长因子受体（EGFR）、ATP、ADAM 10和一氧化氮参与：AG 1478抑制EGFR酪氨酸激酶后ROS下降；P2X7与P2Y2拮抗剂阻断ATP受体信号；ADAM10抑制剂GI254023X抑制木瓜蛋白酶、Der p 1及ATPγS诱导的ROS；1400 W抑制一氧化氮合酶表明一氧化氮为必需环节。
3.3节显示木瓜蛋白酶依赖性ROS涉及TLR1/2与TLR4激活：TAK242抑制TLR4后木瓜蛋白酶、Der p 1、ATPγS响应均下降；CU-CPT22抑制TLR1/2并呈现与Der p 1可比的浓度依赖阻断。
3.4节显示木瓜蛋白酶依赖性ROS涉及TRP通道：TRPV1拮抗剂A784168、TRPV3拮抗剂TRPV3 7a、TRPV4拮抗剂GSK2193874均浓度依赖地减弱ROS，符合PAR激活调制TRP通道的已知关系。
讨论部分总结：研究人员指出木瓜蛋白酶与Der p 1一样，以催化活性启动非经典凝血酶样蛋白酶谱系，经PAR1/PAR4及下游EGFR、嘌呤受体、ADAM10、TLR、TRP通道产生线粒体超氧阴离子与一氧化氮，利于过氧亚硝酸盐形成并驱动IL-33、TSLP、IL-25等Th2相关报警素和细胞因子。早期被忽视的木瓜蛋白酶介导凝血酶原加工具生物学意义；PAR1/PAR4主导响应，PAR2可能经内源蛋白酶级联间接参与。木瓜蛋白酶与Der p 1的S2口袋差异解释其产生不同非经典凝血酶物种，但均具促凝血酶原转化能力。下游ATP经pannexon释放、TLR1/2与TLR4可由PAR转激活或内源配体（纤维蛋白原片段、透明质酸）激活。总体机制是“启动蛋白酶网络”而非单靶点直接切割。
结论部分翻译：本研究确定木瓜蛋白酶为角质形成细胞 intracellular ROS 的强效激活剂，并揭示其启动的信号网络与典型HDM group 1过敏原Der p 1高度相似。与Der p 1一样，激活需要木瓜蛋白酶的催化活性，并涉及通过PAR1和PAR4的凝血酶样信号，以及EGFR、嘌呤受体、ADAM10、Toll样受体和TRP通道的下游参与。木瓜蛋白酶与Der p 1在上皮哨兵细胞中激活这些先天反应的相似性，为其在HDM group 1过敏原实验模型中作为替代物提供了基于机制的支撑，并阐明了木瓜蛋白酶如何在职业和医疗环境中启动过敏致敏。线粒体超氧阴离子是氧化磷酸化条件下产生的主要ROS，且如先前Der p 1所示，木瓜蛋白酶也刺激一氧化氮生成，二者有利过氧亚硝酸盐形成。细胞内ROS是调控上皮细胞因子和报警素反应的关键，包括IL-33、TSLP和IL-25，这些是Th2极化和HDM过敏致敏的核心。本研究发现将木瓜蛋白酶置于与过敏疾病相关的氧化还原依赖上皮激活轴中，该轴可在源头修饰过敏通路。显著发现是凝血酶活性及PAR1/PAR4经典激活的必需性；木瓜蛋白酶介导的凝血酶原激活可能比通常认为的更具生物学意义。PAR1/PAR4机制主导木瓜蛋白酶诱导ROS；PAR2贡献可能有限但可经内源级联间接激活。木瓜蛋白酶可作非经典促凝血酶原转化酶，与Der p 1平行；其产生异质非经典凝血酶物种，保留PAR1/PAR4激活能力而促凝活性改变。底物特异性差异由S2口袋决定：木瓜蛋白酶偏好大疏水残基如苯丙氨酸，Der p 1浅而亲溶剂的S2口袋偏好缬氨酸等小疏水残基；两者S1口袋均较宽且耐受碱性残基，不同于Factor Xa严格精氨酸选择性S1口袋。下游EGFR、嘌呤受体、ADAM10、TRP及TLR1/2、TLR4均与Der p 1模型一致；pannexon介导ATP释放，TLR可由PAR转激活或内源配体激活。综上，木瓜蛋白酶像Der p 1一样是非经典蛋白酶网络启动子；尽管底物偏好和生物信息学一致性一般，其功能汇聚于Der p 1促进过敏致敏的先天信号通路。木瓜蛋白酶和Der p 1的受体药理学反映其生成的主机蛋白酶（此处为凝血蛋白）的特性，而非仅其各自底物特异性。结果从机制上支持木瓜蛋白酶的过敏性，并强化其作为HDM group 1过敏原替代物的资格；更广泛地说，蛋白酶过敏原的生物感知与致敏性应理解为启动蛋白酶网络的后果，而非单个细胞靶点的直接切割，从而将蛋白酶过敏原生物学从线性激活-响应范式重构为网络涌现属性重塑上皮免疫信号。
