凋亡纳米囊泡增强的GelMA水凝胶促进炎症性皮肤创面愈合

《Materials Today Advances》：Apoptotic nanovesicle-reinforced GelMA hydrogel promotes inflammatory skin wound healing

　　

**摘要**

**目的**：炎症主导型皮肤创面因持续性的免疫失调干扰创面愈合的协调进程而难以修复。尽管凋亡囊泡在免疫调节和组织再生方面显示出潜力，但其应用受到产量低、异质性高及局部滞留不足的限制。本研究旨在开发具有增强促修复活性的工程化凋亡纳米囊泡，并利用甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶改善其局部递送效果。

**方法**：研究人员对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）进行UVB诱导凋亡，随后通过梯度挤压生成HUVECs来源的凋亡纳米囊泡（AHNVs）。研究人员将其促修复和免疫调节效应与非凋亡HUVECs来源的纳米囊泡进行了比较。随后将AHNVs整合入GelMA水凝胶，并在小鼠炎症性全层皮肤创面模型中评估所得AHNVs@Gel系统的生物相容性、释放行为、创面滞留及治疗效果。研究人员还对脂多糖（LPS）刺激的骨髓来源巨噬细胞进行了转录组学分析。

**结果**：与非凋亡纳米囊泡相比，AHNVs在体外更有效地促进内皮细胞迁移和血管生成活性，并促进巨噬细胞表型转换。AHNVs@Gel显示出良好的生物相容性、持续的囊泡释放和改善的早期创面滞留。在体内，AHNVs@Gel加速了创面闭合，并与增强的上皮再形成、胶原沉积、血管生成和炎症消退相关。转录组学分析进一步表明，AHNV处理后可减弱干扰素相关的炎症程序。

**结论**：通过梯度挤压工程化凋亡纳米囊泡并将其与水凝胶局部递送相结合，为增强炎症主导型皮肤创面的再生和免疫调节效应提供了一种可行策略。

**基于凋亡纳米囊泡增强GelMA水凝胶的炎症性皮肤创面愈合研究解读**

**一、 研究背景与现存问题**

皮肤创面愈合是一个涉及急性炎症、细胞增殖和组织重塑的复杂生物学过程，需要多种生长因子和细胞因子的协同作用。然而，由烧伤、创伤、糖尿病等病因引起的炎症性皮肤创面，尤其是以持续性免疫失调为特征的炎症主导型创面，因组织修复进程被打乱，仍是临床面临的重大挑战。这类创面不仅给患者带来沉重负担，其复杂的病理微环境也使得传统治疗策略（如控制炎症、维持湿性环境等）疗效有限。因此，开发能够有效调节免疫反应并促进组织再生的新型治疗策略成为创面修复领域的迫切需求。

近年来，细胞凋亡在组织修复中的作用受到关注。凋亡细胞，特别是凋亡的人脐静脉内皮细胞（HUVECs），能够释放携带“找到我”和“吃掉我”信号的凋亡囊泡，这些囊泡可被免疫细胞（尤其是巨噬细胞）优先摄取，从而诱导功能重编程，平衡创面部位的促炎与抗炎状态，促进创面稳定愈合。然而，天然凋亡囊泡的应用受限于产量低、异质性高和批次一致性差等瓶颈。此外，生物囊泡在体内的滞留率低、稳定性差，难以满足炎症创面修复对长期疗效的需求。

**二、 研究目的与策略**

针对上述问题，本研究旨在开发一种新型的工程化凋亡纳米囊泡，并构建一种可局部递送该囊泡的水凝胶系统，以用于炎症性皮肤创面的治疗。研究人员利用梯度挤压技术，对UVB诱导凋亡的HUVECs进行处理，制备出粒径均一、产量高的凋亡HUVECs来源纳米囊泡（AHNVs）。同时，选用具有良好生物相容性和可调物理化学性质的甲基丙烯酰化明胶（GelMA）光交联水凝胶作为局部载体，以实现囊泡在创面部位的持续释放和滞留。通过这种“工程化囊泡+水凝胶递送”的联合策略，研究人员旨在克服天然凋亡囊泡产量不足和体内滞留差的瓶颈，最终评估其在炎症创面修复中的疗效和机制。该研究成果发表于《Materials Today Advances》。

**三、 主要技术方法**

研究人员在开展此项研究中，主要运用了以下关键技术方法：
1. **细胞凋亡诱导与纳米囊泡工程化制备**：对HUVECs进行UVB照射诱导凋亡，随后采用 pneumatic extruder（气压挤出器，型号NanoAble-150）配合不同孔径（1.2 μm, 0.6 μm, 0.22 μm）的聚碳酸酯滤膜进行梯度挤压，结合超速离心（100,000 × g, 2 h）纯化获得AHNVs。
2. **水凝胶合成与表征**：使用商用GelMA（甲基丙烯酰化度60%）和LAP光引发剂，通过405 nm光源照射制备光交联水凝胶。利用扫描电子显微镜（SEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、1H核磁共振（1H NMR）等手段表征其理化性质，并评估其溶胀率、降解行为、生物相容性（溶血实验、细胞活力）和体外释放曲线。
3. **体外细胞学功能评价**：采用CCK-8实验评估纳米囊泡对HUVECs增殖的影响；通过细胞划痕实验和Transwell实验评估细胞迁移能力；在Matrigel基质上进行管状结构形成实验评估血管生成能力；利用流式细胞术和酶联免疫吸附测定（ELISA）检测巨噬细胞极化标志物（CD86, CD206）及细胞因子（IL-1β, TNF-α, IL-4, IL-10）分泌水平。
4. **体内动物模型建立与评价**：在C57BL/6小鼠背部建立直径约1.0 cm的全层皮肤缺损创面，并在创面局部皮下注射0.5 mg/kg脂多糖（LPS）构建炎症主导型创面模型。将小鼠分为PBS、GelMA、HNVs@Gel和AHNVs@Gel四组进行治疗，通过创面拍照、组织学染色（H&E, Masson）、免疫荧光染色（CD31, α-SMA, CD86, CD206）和免疫组化（IL-6, TGF-β）等分析评价愈合效果。
5. **转录组学测序分析**：对LPS刺激的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）进行RNA-seq测序，结合GO、KEGG富集分析和基因集富集分析（GSEA）解析AHNVs处理后的转录组变化。

**四、 研究结果**

**2.1. HNVs/AHNVs的制备与表征**
通过UVB照射和梯度挤压技术成功制备了非凋亡来源的纳米囊泡（HNVs）和凋亡来源的纳米囊泡（AHNVs）。透射电镜（TEM）和纳米颗粒跟踪分析（NTA）显示，两种囊泡均呈典型的杯状形态，粒径分别约为101 nm和169 nm。Western blot结果显示，AHNVs中凋亡标志物Caspase-3和Bcl-2的表达水平显著高于HNVs，证实UVB照射有效诱导了细胞凋亡。细胞摄取实验表明，巨噬细胞对AHNVs的内吞效率高于HNVs，提示AHNVs可能更早地发挥生物学功能。

**2.2. HNVs/AHNVs体外促进细胞增殖、迁移和血管生成**
CCK-8实验结果显示，HNVs和AHNVs均能在48小时内显著促进HUVECs增殖，其中50 μg/mL的AHNVs促增殖效果最为显著，被确定为后续研究的最佳浓度。细胞划痕和Transwell迁移实验证实，AHNVs在促进细胞侧向迁移（创面收缩）和垂直迁移（组织填充）方面均表现出最佳效果。Matrigel血管生成实验进一步表明，HNVs和AHNVs能显著促进HUVECs形成管状结构，增加血管样结构的数量、节点数和管长，其中AHNVs的促血管生成作用更为优越。

**2.3. HNVs/AHNVs促进M2型巨噬细胞重编程**
为模拟炎症微环境，研究人员使用LPS刺激RAW264.7细胞，成功构建了M1型炎症巨噬细胞模型（F4/80+CD86+细胞比例从3.44%升至61.3%）。在此基础上，流式细胞术和ELISA结果显示，与HNVs相比，AHNVs能更显著地降低M1型标志物（CD86）和促炎细胞因子（IL-1β, TNF-α）的分泌，同时增加M2型标志物（CD206）和抗炎细胞因子（IL-4, IL-10）的水平，表明AHNVs具有更强的诱导巨噬细胞向促愈合（M2）表型转换的能力。

**2.4. GelMA水凝胶的合成与表征**
FTIR和1H NMR图谱证实了 GelMA的成功合成。GelMA前体溶液在LAP光引发剂和405 nm光照下可快速形成稳定的水凝胶。SEM图像显示冻干后的水凝胶具有多孔且相互连通的三维网络结构。体外释放实验表明，GelMA能实现HNVs和AHNVs的持续释放。重要的是，体内荧光成像显示，GelMA包封显著提高了囊泡在创面部位早期（0, 12, 24, 48 h）的滞留率。溶血实验和细胞活力分析一致证实了GelMA具有良好的血液相容性和细胞相容性。

**2.5. 载囊泡水凝胶促进炎症创面愈合的体内评价**
在小鼠炎症性全层皮肤创面模型中，与对照组（82.3%）相比，HNVs@Gel和AHNVs@Gel组在术后第15天的创面闭合率分别达到95.4%和98.6%。尤其重要的是，AHNVs@Gel组在术后第8天即达到63.2%的闭合率，远高于对照组的27.2%，显示出显著加速的早期愈合动力学。

**2.6. 组织学分析**
H&E染色显示，术后第15天，AHNVs@Gel组的再生皮肤在结构和表皮厚度（54.76 μm）上最接近正常皮肤（28.36 μm），且能观察到皮肤附属器和成熟血管结构。Masson染色结果表明，AHNVs@Gel组的胶原沉积比例更接近正常皮肤，且胶原纤维排列呈现类似天然组织的编织状，而对照组和GelMA组胶原更粗大、致密，呈现肥大性疤痕的特征。这些结果证实AHNVs@Gel能促进上皮再形成和优化胶原沉积。

免疫荧光染色进一步揭示了AHNVs@Gel在促进血管成熟和调节炎症方面的作用。在术后第8天，AHNVs@Gel组的血管生成标志物（CD31和α-SMA）阳性表达显著高于其他组；到第15天，其新生血管形态趋于成熟细长，而对照组仍为未成熟的小圆形血管。同时，AHNVs@Gel组的M1型巨噬细胞标志物CD86表达显著降低，M2型标志物CD206表达显著升高。免疫组化染色也证实该组IL-6阳性面积减少，TGF-β阳性面积增加，表明其有效调节了创面微环境，抑制了炎症并促进了组织修复。

**2.7. RNA-seq转录组学分析**
对LPS刺激的BMDMs进行RNA-seq分析，结果显示AHNV处理与LPS对照组之间存在显著的转录组差异（上调基因3213个，下调基因1294个）。GO富集分析显示，下调基因富集于炎症和先天免疫相关通路（如对脂多糖的细胞反应、对干扰素-β的细胞反应）；上调基因则富集于组织重塑和修复相关通路（如细胞外基质组织、细胞黏附、血管生成）。GSEA进一步证实，AHNV处理显著负富集了“对干扰素-β的细胞反应”和“I型干扰素介导的信号通路”，并鉴定出一系列代表性下调基因（如Stat1, Irf7, Ifit3等）。KEGG分析也表明下调基因富集于TNF、JAK-STAT和NOD样受体等炎症信号通路，而上调基因富集于ECM-受体相互作用、黏着斑和TGF-β等修复相关通路。

**五、 总结与讨论**

本研究的讨论部分强调，通过梯度挤压技术工程化的AHNVs，因携带凋亡相关信号，具备更强的免疫调节和促修复活性。将AHNVs结合GelMA水凝胶局部递送，有效解决了囊泡在体内容易被清除、滞留时间短的问题，为炎症创面提供了一个可持续发挥作用的“生物活性支架”。这种联合策略在动物模型中显著加速了创面愈合，其机制与促进M2型巨噬细胞极化、抑制干扰素相关炎症程序、增强血管生成和优化胶原重塑密切相关。

**研究结论**：在本研究框架内，通过UVB处理和梯度挤压从HUVECs生成的凋亡纳米囊泡，其促修复和免疫调节活性优于非凋亡来源的纳米囊泡。将AHNVs整合入可光固化的GelMA水凝胶中，形成的AHNVs@Gel系统通过增强上皮再形成、胶原沉积、血管生成和炎症消退，显著加速了小鼠炎症性全层皮肤创面的愈合。转录组学分析进一步支持了AHNV处理能减弱干扰素相关炎症程序，并促进修复性重塑。综上，工程化凋亡纳米囊泡结合水凝胶局部递送，为炎症主导型创面修复提供了一种可行策略。同时，该研究也存在局限性，例如模型为LPS诱导的急性炎症模型而非更严苛的慢性创面模型，未与天然凋亡囊泡进行直接比较，机制探讨主要基于表型和转录组证据，未来需要在慢性创面模型中进行更深入的因果验证。