分娩后小鼠睾丸中 phoenixin-14 和 GPR173 基因及蛋白的表达及其对早期类固醇生成的影响

《The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology》：Postnatal expression of phoenixin-14 and GPR173 gene and protein in the mice testis and its effect on steroidogenesis in the early stage

　　

摘要

Phoenixin-14是一种神经肽，已被证实能够与GPR173结合并进行生物学功能活动。其表达存在于多种组织中，包括猪、人和大鼠的卵巢。然而，目前尚无关于它在大鼠出生后睾丸中的表达情况的信息。Phoenixin-14由Smim20基因编码。本研究显示，Smim20和Gpr173的mRNA表达量从出生后第7天（PND7）开始下降，到出生后第65天（PND65）时达到最低。由于市售Phoenixin-14抗体的供应有限，我们在大鼠体内制备了自己的抗体，并通过ELISA、免疫组化和点印迹实验对其进行了验证。免疫组化结果显示Phoenixin-14和GPR173存在于生精小管和莱迪希细胞（Leydig cells）中。出生后第65天的莱迪希细胞中，GPR173的染色较强，而Phoenixin-14的染色中等。共定位研究进一步表明Phoenixin-14和GPR173在睾丸中共表达。这些结果证明，Phoenixin-14和GPR173的表达在出生后的发育过程中受到调控。Phoenixin-14和GPR173在生殖细胞中的存在暗示了它们可能在类固醇生成过程中发挥作用。此外，在出生后第28天至第65天期间，Cyp11a1和Cyp17a1基因的表达也有所增加，这与其他研究报道的睾酮水平升高相吻合。因此，Phoenixin-14和GPR173的变化可能也参与了睾酮的分泌调控。我们的体外实验表明，Phoenixin-14在两种不同剂量（10 nM和100 nM）下都能刺激睾酮分泌，其中较低剂量下的分泌量更高，并且类固醇生成相关基因（Cyp11a1、Cyp17a1、Star和Hsd17b1）的表达也增加。总之，睾丸中的Phoenixin-14/GPR173可能在不同的出生后阶段调节睾酮分泌。

引言

已知小鼠的精子发生始于出生期。在六周龄时，小鼠的附睾中已有具有功能的精子，从而确保了其早期的生殖能力。这是因为第一次精子发生发生在出生后第六周，即PND35 [1]。众所周知，体细胞与生殖细胞的相互作用对精子发生至关重要。此外，睾丸在出生后的发育阶段表现出特定的基因和蛋白质表达模式，这是精子发生的前提条件 [2]。

近年来，研究表明脂联素和肽类在生殖和生育能力中起着新的作用 [3]。Phoenixin（PNX）是一种新发现的与生殖相关的肽，包含两种活性异构体PNX-14和PNX-20 [4]。Phoenixin-14由Smim20（Small Integral Membrane Protein 20）基因编码的前体蛋白衍生而来 [5]。PNX在下丘脑产生，并直接影响垂体的性腺激素释放激素（gonadotrophs）[6]。初步研究表明，PNX通过调节kisspeptin、GnRH、GnRH受体、LH和发情周期的表达来影响下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴 [4]。最初认为它是一种生殖肽，因为它能上调GnRH受体mRNA并增强GnRH受体的表达，从而促进雌性垂体细胞产生黄体生成素（LH）[7]。然而，后续研究表明，PNX可能在多种生理过程中发挥作用，包括抑制内脏疼痛、引发瘙痒、引起焦虑以及改善记忆保持 [4]。PNX受体是通过siRNA介导的GPR173敲低实验发现的，GPR173是一种被认为能与PNX结合的孤儿受体 [8]。

先前的研究显示，其他肽类及其受体（如apelin、apelin受体、visfatin、vaspin和GRP78）在小鼠睾丸中的表达会随着发育阶段的变化而变化 [9] [10] [11]。PND65代表完全成年期的小鼠；因此，这一阶段对于了解从青春期（PND42）到成年期的变化非常重要 [12,13]。此外，PNX-14已在雄性和雌性大鼠的多种组织中检测到其存在，包括下丘脑、垂体、大脑、小脑、肾上腺、卵巢和睾丸 [14]。然而，目前尚未有研究探讨小鼠出生后睾丸中PNX-14和GPR173的表达和定位情况。此外，市售的PNX-14抗体也不容易获得。因此，本研究重点制备了针对PNX-14的抗体，以实现对其在出生后不同发育阶段睾丸中的特异性检测和定位，并研究PNX-14和GRP173的基因表达。同时，本研究还探讨了PNX-14对睾丸类固醇生成的影响。

章节片段

动物饲养

本研究使用雌性Wistar大鼠和雄性瑞士白化小鼠。实验动物在标准受控条件下饲养，光照周期为12小时/天，温度为25±2°C，食物和水可自由获取。所有实验均遵循印度米佐拉姆大学动物伦理委员会（协议批准号 MZU/IAEC/2024–25/14）的指南进行。所有动物实验均符合ARRIVE标准。

Phoenixin-14抗体的验证

抗体的特异性通过三步法进行验证。首先使用免疫血清和预免疫血清进行ELISA测试。抗PNX-14肽的抗体滴定范围为1:50至1:4000，结果显示信号强度随稀释度增加而逐渐增强，最高稀释度为1:50时信号最强（见图1A）。同一动物的预免疫血清对PNX-14肽无结合反应。

讨论

本研究报告了小鼠出生后睾丸中PNX-14及其受体GRP173的表达和定位情况。由于市售抗体的来源有限，我们自行制备了针对PNX-14的抗体。我们使用与KLH结合的PNX-14在大鼠体内制备了这种抗体。ELISA结果显示，抗PNX-14血清的吸光度随剂量增加而降低；然而，同一动物的预免疫血清对PNX-14无结合反应。

作者贡献声明

Dombera K. Marak：撰写、审阅与编辑、初稿写作、数据可视化、验证、正式分析、概念构建。Guruswami Gurusubramanian：撰写、审阅与编辑、初稿写作、数据可视化、验证、正式分析、概念构建。Vikas Kumar Roy：撰写、审阅与编辑、初稿写作、数据可视化、验证、监督、资源管理、方法学设计、实验实施、正式分析、数据管理。

资金支持

本研究未接受任何资金支持。

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

Dombera K. Marak衷心感谢新德里的CSIR提供的资助（项目编号09/0864(20751)/2024-EMR-I）。同时，我们也感谢新德里DST-FIST为米佐拉姆大学动物学系提供的研究设施。

Dombera K. Marak|Guruswami Gurusubramanian|Vikas Kumar Roy
米佐拉姆大学动物学系，Aizawl, 米佐拉姆，796004，印度