《The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology》：FDFT1 is associated with ovarian reserve and regulates proliferation and steroidogenesis in the human granulosa cell line KGN via the AKT/mTOR signaling pathway
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卵巢储备功能减退（DOR）导致女性卵巢内分泌功能下降和生育力降低，进而引起不孕。脂质代谢失调可通过干扰胆固醇代谢和激素合成而损害正常卵泡发育，从而促成DOR的发生。法尼基二磷酸法尼基转移酶1（FDFT1）是胆固醇生物合成通路中的关键酶，其在DOR发病机制中的作
卵巢储备功能减退（DOR）导致女性卵巢内分泌功能下降和生育力降低，进而引起不孕。脂质代谢失调可通过干扰胆固醇代谢和激素合成而损害正常卵泡发育，从而促成DOR的发生。法尼基二磷酸法尼基转移酶1（FDFT1）是胆固醇生物合成通路中的关键酶，其在DOR发病机制中的作用尚不清楚。本研究探讨了人颗粒细胞（GCs）中FDFT1表达与卵巢储备功能之间的关系，并进一步在体外考察了FDFT1对KGN细胞系生物学功能的影响。结果显示，DOR患者GCs中FDFT1表达显著下调，且与FSH升高及AMH和AFC水平降低相关。在体外，FDFT1敲低抑制颗粒细胞增殖，诱导细胞周期阻滞，并促进细胞凋亡；同时降低细胞内类固醇激素合成。机制上，FDFT1敲低抑制了AKT/mTOR通路。值得注意的是，药理学激活该通路可有效逆转FDFT1敲低诱导的KGN细胞功能障碍。总之，FDFT1有望作为评估颗粒细胞功能和卵巢储备功能的新型生物标志物及治疗靶点，为DOR发病机制提供新的分子见解。
一、研究背景与意义
卵巢储备功能减退（DOR）是导致女性不孕的常见临床原因，其特点是卵巢卵泡数量减少、卵母细胞质量下降，并伴随抗苗勒管激素（AMH）水平降低、窦卵泡计数（AFC）减少及促卵泡激素（FSH）水平升高等生物标志物异常。DOR的报道患病率为10%至35%，很大程度上是由于缺乏统一的诊断标准。尽管DOR与疾病、衰老和环境等多种因素相关，但其确切发病机制仍不清楚，对生殖医学构成重大挑战。目前辅助生殖技术（ART）是主要的治疗手段，但仍面临获卵数低和胚胎质量差等局限性。颗粒细胞（GCs）通过产生类固醇激素和表达性激素受体，在卵泡发育和卵母细胞成熟中发挥关键作用，因此阐明颗粒细胞功能障碍是理解DOR发病机制的核心。
胆固醇是雌二醇等类固醇激素合成所必需的前体物质，其在颗粒细胞内的代谢调控尤为关键。研究表明，胆固醇代谢失调可能损害女性生育力，并通过影响细胞稳态而参与DOR的发病。法尼基二磷酸法尼基转移酶1（FDFT1），又称角鲨烯合酶，是胆固醇生物合成通路中的关键调控酶。该酶在多种癌症中高表达并与不良预后相关，在脂质代谢、细胞增殖和侵袭中发挥重要作用。然而，FDFT1在女性生育力和颗粒细胞生物学中的功能尚未阐明。
在细胞层面，卵泡发育依赖于颗粒细胞的快速增殖和功能分化，而PI3K/AKT/mTOR信号通路在此过程中作为整合营养信号、能量状态和生长因子的中枢枢纽。在卵巢生物学中，该通路通过调控颗粒细胞生长和凋亡影响卵泡发育。已有研究证实该通路参与保护大鼠卵巢颗粒细胞免受氧化应激和凋亡，并参与类固醇生成的调控。基于上述证据，研究人员假设FDFT1至少部分通过AKT/mTOR信号通路调控颗粒细胞功能，且FDFT1的异常表达与DOR相关。本研究旨在验证这一假设，为DOR的发病机制和潜在生物标志物的发现提供实验证据。该论文发表在《The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology》。
二、主要技术方法
研究人员收集了来自上海长征医院和兰州大学第一医院生殖医学中心接受IVF/ICSI取卵术女性的卵泡液样本，共纳入正常卵巢储备（NOR）组32例和DOR组32例，年龄均在20至35岁之间。通过密度梯度离心和红细胞裂解从卵泡液中分离原代人颗粒细胞，提取RNA进行qRT-PCR检测FDFT1表达。体外实验采用人颗粒细胞系KGN作为模型，通过siRNA介导的基因敲低和质粒介导的过表达进行功能获得与功能丧失研究。主要技术手段包括：qRT-PCR检测mRNA表达水平、Western blotting检测蛋白表达水平、CCK-8和EdU实验评估细胞增殖、流式细胞术分析细胞周期分布和凋亡率、Amplex Red试剂盒测定细胞内总胆固醇和胆固醇酯含量、ELISA检测细胞培养上清中雌二醇（E2）水平。此外，使用AKT激活剂SC79进行通路干预实验以验证机制。
三、研究结果
3.1 FDFT1表达水平与卵巢储备功能相关
通过qRT-PCR检测NOR组和DOR组患者颗粒细胞中FDFT1的表达水平，结果显示DOR组FDFT1表达显著低于NOR组。相关性分析表明，FDFT1表达与FSH水平显著负相关，与AMH和AFC水平显著正相关，经Bonferroni校正后仍具有统计学意义。多变量线性回归分析显示，在校正年龄和BMI后，较高的FDFT1表达与较低的FSH水平、较高的AFC和较高的AMH独立相关，提示FDFT1可能与卵巢储备功能呈正相关。
3.2 FDFT1敲低抑制KGN细胞增殖和细胞周期进程并促进凋亡
通过siRNA介导的FDFT1敲低实验发现，FDFT1敲低显著降低KGN细胞活力，EdU阳性细胞数减少。qRT-PCR结果显示FDFT1敲低显著抑制增殖和细胞周期相关基因（PCNA、CDK2、CDK4、CDK6、CCNE1、CCND1）的表达，同时上调CDKN1A表达。流式细胞术分析显示FDFT1敲低诱导G0/G1期细胞周期阻滞，S期细胞比例显著减少。Western blotting证实相关蛋白水平同步下调。凋亡分析显示FDFT1敲低显著增加早期和晚期凋亡细胞比例，上调促凋亡基因BAD、p53、CASP8和BAX的表达，下调抗凋亡基因BCL-2表达，BAX蛋白表达上调而BCL-2蛋白表达下调。
3.3 FDFT1过表达促进KGN细胞增殖和细胞周期进程并抑制凋亡
通过质粒介导的FDFT1过表达实验发现，FDFT1过表达显著增加KGN细胞活力，EdU阳性细胞数增多。qRT-PCR结果显示FDFT1过表达上调PCNA、MCL1、CDK2、C-MYC、CCNE1和CCND1的表达，下调CDKN1A表达。流式细胞术显示S期细胞比例显著增加，表明细胞周期进程加快。Western blotting证实PCNA、CDK2、C-MYC、CCNE1、CCND1和CDK4蛋白水平显著升高。凋亡分析显示FDFT1过表达降低凋亡率，下调BAD、CASP3、CASP8和BAX的mRNA表达，BAX蛋白表达下调而BCL-2蛋白表达显著上调。
3.4 FDFT1调控KGN细胞胆固醇含量和类固醇激素合成
由于FDFT1是胆固醇合成的关键酶，而胆固醇是类固醇激素的前体，研究人员检测了FDFT1敲低和过表达对胆固醇合成、类固醇激素产生及培养上清中E2水平的影响。结果显示FDFT1敲低显著降低KGN细胞内总胆固醇和胆固醇酯水平，显著降低类固醇生成相关基因CYP11A1、CYP19A1、HSD17B1和STAR的mRNA水平，以及STAR、CYP11A1和CYP17A1的蛋白水平，培养上清中E2水平降低。FDFT1过表达则产生相反效应。
3.5 FDFT1敲低通过抑制AKT/mTOR通路损害KGN细胞功能
Western blotting分析显示FDFT1敲低显著降低KGN细胞中AKT和mTOR的磷酸化水平，而FDFT1过表达则增强该通路的活性。使用AKT激活剂SC79处理可逆转FDFT1敲低诱导的细胞功能障碍，表现为细胞增殖增强、凋亡减少、胆固醇水平和雌二醇分泌增加。SC79还抵消了FDFT1敲低对AKT和mTOR磷酸化的抑制作用。
四、讨论与结论
讨论部分指出，DOR是常见的临床不孕原因，目前治疗手段在改善卵巢储备功能方面仍有限。本研究聚焦于年轻女性中发生的病理性DOR，其特点是独立于年龄的卵巢功能过早衰退。研究发现FDFT1在DOR患者颗粒细胞中表达下调且与卵巢储备功能正相关，提示FDFT1下调可能是影响卵巢储备功能的关键因素。在分子机制层面，FDFT1缺陷可能通过抑制CDK/周期蛋白活性阻碍细胞周期进程，BAX/BCL-2比值的升高是线粒体凋亡通路激活的重要指标。FDFT1还可能通过调控胆固醇供应影响类固醇生成。关于FDFT1调控AKT/mTOR通路的具体机制，研究人员推测可能与胆固醇影响膜脂筏结构和受体信号传导效率有关，但尚需进一步研究验证。
研究结论部分翻译如下：总之，本研究证明FDFT1在DOR患者的颗粒细胞中显著下调，并与卵巢储备功能呈正相关。利用KGN细胞模型，研究人员证明FDFT1通过AKT/mTOR信号通路调控颗粒细胞增殖、细胞周期进程和凋亡，并可能参与调控颗粒细胞中的类固醇生成和雌激素信号。这些发现增进了对DOR发病机制的理解，并提示FDFT1可能作为卵巢储备评估的潜在生物标志物或治疗靶点。
