一种用于可逆“关闭-开启”Fe3?/抗坏血酸氧化还原传感及斑马鱼生物成像的多功能AIE荧光探针

《Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry》：A multifunctional AIE fluorescent probe for reversible ‘turn-off-on’ Fe3+/ascorbic acid redox sensing and zebrafish bioimaging

　　

## 摘要要点

• HDB能够在99.999%的水性介质中实现基于AIE的Fe3?检测（检出限2.94 nM）。
• Fe3?和AA通过氧化还原驱动的荧光开关实现可逆传感。
• TCSPC证实了动态猝灭机制，DFT揭示了O-H···N相互作用。
• HDB支持IMP逻辑门操作和可重写的水墨防伪应用。
• HDB具有生物相容性，可实现斑马鱼成像与真实样品验证。

## 引言

铁和抗坏血酸（AA，即维生素C）是人类生物学中最重要的两种小分子，其生化命运通过基本的氧化还原关系相互关联。三价铁（Fe3?）是有氧条件下主要的循环氧化态，对血红蛋白介导的氧气运输、线粒体电子传递、DNA复制和酶促催化至关重要。然而，当其稳态平衡被打破时，Fe3?参与Haber-Weiss和Fenton型反应，生成高活性的羟基自由基（•OH），对细胞脂质、蛋白质和核酸造成不可逆的氧化损伤。铁代谢紊乱与多种致命性疾病存在因果关系，包括遗传性血色素沉着症、帕金森病和阿尔茨海默病等神经退行性疾病、肝硬化、地中海贫血以及缺血再灌注损伤。除临床医学外，饮用水中的Fe3?污染也是重要的环境问题：美国环境保护署（EPA）规定饮用水中Fe3?的最大允许浓度为0.3 mg/L（5.4 μM）。

AA是哺乳动物水相环境中含量最丰富的低分子量抗氧化剂，调控胶原蛋白生物合成、免疫激活、通过TET双加氧酶进行表观遗传调控、通过多巴胺β-羟化酶活性进行神经调节以及活性氧（ROS）的清除。每日推荐摄入量（RDA）为男性90 mg/天，女性75 mg/天；血浆浓度低于11 μmol/L在临床上可诊断为缺乏症，表现为坏血病、伤口愈合受损和免疫防御力下降。在机制上，AA将Fe3?还原为Fe2?，该反应调控肠道铁的生物利用度、抗氧化网络循环和氧化应激管理。这种氧化还原偶联使其可在单一传感架构中共检测，兼具分析实用性和生理相关性。

Fe3?和AA的精确量化传统上通过一系列成熟的分析方法实现，包括原子吸收光谱法（AAS）、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）、电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）、紫外-可见分光光度法、高效液相色谱法（HPLC）、毛细管电泳法（CE）、电化学技术和酶辅助比色法。这些技术在受控实验条件下可提供可靠的定量精度，但其实际应用常受到显著操作限制的约束。光谱技术如ICP-MS、ICP-OES和AAS需要高温等离子体或原子化系统、持续气体供应以及高昂的运行成本。色谱方法涉及繁琐的样品制备和较长的分离过程，而电化学方法则受限于电极钝化、表面污染和复杂基质中的信号不稳定性。此外，大多数常规技术采用批量工作流程，需要破坏性采样，限制了其快速或连续监测的适用性。关键的是，这些方法均无法将Fe3?-AA的顺序氧化还原相互作用转化为单一可区分的分析光学信号，也不支持在活体生物系统中进行实时成像。

基于荧光的化学传感直接解决了上述局限性。荧光探针具有极高的检测灵敏度和极低的背景干扰，能够实现高度稀释或复杂样品中痕量水平的检测。荧光检测的光学特性允许快速、非破坏性分析，几乎瞬间产生信号，便于化学转化的实时监测。与常规技术相比，荧光测量需要简单得多的仪器和极少的样品预处理。荧光探针可集成到紧凑型光学设备、微流控传感系统和可部署现场的分析工具中，实现快速环境监测和即时检测诊断。此外，荧光检测通过兼容共聚焦荧光显微镜和活细胞成像，独特地实现了分析物的空间分辨可视化，允许直接观察活体系统中分析物的分布和动态生化过程，这是常规检测方法无法触及的分析维度。

大量研究工作致力于开发Fe3?和AA检测的荧光探针，所用材料涵盖重金属和杂原子掺杂量子点（QDs）、镧基发光配合物、金属有机框架（MOFs）、共轭聚合物、DNA模板化金/银纳米簇（Au/Ag NCs）、双金属纳米结构、石墨烯量子点（GQDs）、氧化酶模拟纳米酶、纳米片和常规有机小分子荧光团。尽管其结构多样，但这些材料类别共享关键缺陷。含重金属的量子点具有显著的细胞毒性；镧基配合物前驱体成本高昂且对水分敏感；MOF基传感器在水相中结构脆弱；聚合物基探针和GQDs存在批次间变异性；纳米酶基系统需要严格检测条件，与真实世界样品多样性不兼容。常规有机荧光团在水环境中屈服于聚集诱导猝灭（ACQ）。在单一氧化还原响应光学平台上顺序检测Fe3?和AA仅有少数系统报道，且无一同时满足近纯水操作、低细胞毒性、亚纳摩尔灵敏度、机制光物理验证和体内生物成像应用的苛刻要求。这一未解决的空白激发了本研究。

聚集诱导发光（AIE），一种与ACQ截然相反的光物理范式，为弥补这些不足提供了可行途径。AIE活性分子在分子溶解状态下因自由分子内旋转和振动而不发光，但在聚集过程中通过限制分子内运动（RIM）产生增强的荧光，关闭非辐射衰减通道并将激发能重新导向辐射发射。这种聚集态发光增强天然适合水性生物环境，完全避免了重金属毒性，并实现结构明确、批次可重复的合成。

基于这些属性和上述未解决的分析空白，本研究报道了HDB的设计、合成和全面多功能研究——一种在99.999%水性介质（H?O/DMSO = 99.999:0.001, v/v）中操作的AIE活性席夫碱荧光团，用于Fe3?和AA的高选择性顺序氧化还原偶联型"关-开"检测。基于支持信息表S-3的对比文献分析，本HDB平台结合了高水相中可逆Fe3?/AA氧化还原传感、DFT分析、真实样品验证和体内斑马鱼生物成像，从而扩展了先前报道的AIE活性传感系统的范围。HDB将AIE与明确的分子间氢键相互作用相结合，提供亚纳摩尔检出限和宽线性动态范围。AIE行为通过DFT计算进行了严格阐明。MTT细胞毒性实验证实了HDB在3T3-L1成纤维细胞中的生物相容性，其IC50远高于所有传感实验中所用的探针浓度。"关-开"荧光模式在活体斑马鱼胚胎中进行了实时胞内Fe3?和AA成像验证。可逆AIE开关行为被进一步用于制备可重写的水墨防伪基底，顺序Fe3?-AA光学响应被编码为分子蕴含（IMP）逻辑门，共同确立了HDB作为多功能传感平台的地位，其在环境监测、食品安全和分子信息处理中的适用性已得到证实。

## 材料与仪器

所有试剂和溶剂（纯度≥99.9%，ACS/ISO认证试剂级）购自Sigma-Aldrich公司（美国）和Sisco Research Laboratories（SRL，印度），未经进一步纯化直接使用。2,4-二羟基苯甲醛和肼水合物（NH?-NH?·H?O）作为HDB的合成前驱体。金属离子选择性实验采用新配制的Zn2?、Cd2?、Co2?、Fe2?、Cu2?、K?、Ni2?、Mn2?、Cr3?、Hg2?、Mg2?、Ca2?、Cr??等的硫酸盐、氯化物或硝酸盐溶液。

## 光学性质的实验分析

在纯DMSO和99.999%水性介质中记录HDB的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱，以阐明基态和激发态光物理行为以及溶剂依赖性响应。在纯DMSO中的紫外-可见光谱中，可分辨三个特征跃迁：源自芳香族2,4-二羟基苯基发色团的π→π*吸收带位于310 nm，源自亚胺氮和酚氧原子孤对电子的n→π*肩峰位于340 nm，以及一个主导吸收带……

## 结论

本工作通过合理设计和合成HDB——一种在近纯水介质中操作的AIE活性席夫碱荧光团，代表了荧光基化学传感的重大进展。AIE行为从机制上根植于由O-H···N分子间网络强化的RIM，通过DFT计算和DLS测量进行了严格验证。HDB对Fe3?和抗坏血酸均实现了超低亚纳摩尔检出限，轻松超越了……

## CRediT作者贡献声明

Subash Jacob：原创草稿撰写、验证、方法论、研究、数据整理。Jayaprakash Jayaraman：原创草稿撰写、方法论、形式分析、数据整理。Harish Rahul Sampath：可视化、验证、形式分析。Shana Balachandran：研究、数据整理。Mir Intaj Ali：方法论、形式分析。Arun Dhurey：研究、数据整理。Madan Kumar Arumugam：审阅与编辑、验证、资源、形式分析。Souvik Pal等：……

## 伦理声明

所有成像实验均符合印度政府CPCSEA（动物实验控制与监督委员会）指南；自由摄食阶段前的斑马鱼胚胎和幼虫不被视为保护动物，因此不需要机构动物伦理委员会批准。此外，由于未报告患者数据，本研究免除了伦理批准。

## 作者声明

代表所有共同作者，本人Subhenjit Hazra博士（通讯作者）确认，本手稿代表原创工作，此前未曾发表，也未被其他地方考虑中。所有作者已阅读并批准最终手稿，且无利益冲突需要声明。

## 利益冲突声明

作者声明不存在已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

## 致谢

SJ和SH感谢印度政府UGC-DAE CSR提供的财政支持（项目编号：CRS/2021-22/04/617）。

**作者列表：** Subash Jacob, Jayaprakash Jayaraman, Harish Rahul Sampath, Shana Balachandran, Mir Intaj Ali, Arun Dhurey, Madan Kumar Arumugam, Souvik Pal, Shamima Hussain, Amrita Pal, Animesh Pramanik, Subhenjit Hazra