660纳米的光生物调节作用可减弱类骨关节炎细胞模型中的炎症-分解代谢相关转录程序

《Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology》：660 nm photobiomodulation attenuates inflammatory-catabolic transcriptional programs in an osteoarthritis-like cellular model

　　

摘要

光生物调制（PBM）在调节骨关节炎（OA）相关的炎症和软骨退化方面显示出潜力，但不同研究中使用的照射条件差异很大，且通常通过选定的基于标志物的终点来进行评估。与选定PBM条件相关的转录组反应在OA样细胞中仍未得到充分定义。在这里，我们应用了控制变量筛选设计来识别一种有效的660纳米PBM条件，用于IL-1β诱导的SW1353细胞，并进一步表征了相关的转录组反应。PBM在不同辐照度和能量密度下的效果通过细胞活力和IL6/MMP13表达作为代表性的炎症-代谢读数来进行评估。在测试范围内，PBM通常可以降低IL-1β诱导的IL6和MMP13表达，其抑制效应呈现双相、窗口依赖的模式。在所测试的参数中，5毫瓦/平方厘米（18焦耳/平方厘米的总剂量）产生了最一致的抑制效果。在该选定的条件下进行RNA测序（RNA-seq）显示PBM处理后转录组发生了协调性重塑。PBM抑制了主要的炎症-代谢程序，包括TNF、核因子κB（NF-κB）、IL-17、JAK–STAT和细胞因子相关的信号通路，同时部分逆转了IL-1β引起的细胞组织和代谢途径的变化。PBM逆转基因分析确定了157个在OA和PBM条件下表达趋势相反的基因。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）和以IL6/MMP13为中心的共表达分析表明，PBM响应基因集中在细胞因子/趋化因子信号通路、NF-κB相关调控和细胞外基质降解模块上。RT-qPCR验证确认了这些模块中代表性节点的下调，包括IRAK2、NFKBIA、TNFAIP3、IL6、CXCL8、CCL2、MMP13和MMP3。这些发现为理解PBM在OA样SW1353细胞中调节炎症-代谢反应的机制提供了转录组框架。

引言

骨关节炎（OA）是一种多因素关节疾病，其特征是影响整个关节器官的结构和功能变化[1]。最近的全球负担估计显示，2021年全球约有6.07亿人患有OA，预计到2050年这一数字将接近10亿[2]、[3]、[4]。尽管其具有重大的社会经济和临床负担，但目前的治疗策略主要提供症状缓解，而改变疾病进程的干预措施仍然有限[5]、[6]、[7]、[8]。在分子水平上，OA的进展是由机械应力、老化相关的细胞功能障碍、代谢失衡和低度炎症之间的复杂相互作用驱动的[9]。多种起始因素，包括机械过载、老化和炎症刺激，可以激活相互连接的信号通路和调控网络[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。如Wnt、核因子κB（NF-κB）、TGFβ/BMP、FGF和JAK–STAT等通路通过相互作用和反馈机制来调节参与软骨细胞应激反应、细胞因子产生、趋化因子释放和ECM降解的下游介质[9]。虽然这些信号通路在功能上有所不同，但许多最终都集中在OA的两个主要病理结果上：慢性炎症和细胞外基质（ECM）的破坏[14]。这些生物过程由细胞因子、趋化因子和降解基质的酶网络驱动，共同导致软骨退化和疾病进展[15]。在下游因素中，基质金属蛋白酶-13（MMP13）是胶原酶中功能最强的肽酶，其对II型胶原（Col2）和明胶的催化速率远高于其他MMPs[16]、[17]、[18]。同时，炎症细胞因子如IL6会加剧炎症，并可能通过IL6/STAT3相关的信号通路增强代谢反应[19]。因此，IL6和MMP13被广泛用作关节炎研究中炎症激活和基质降解的代表性指标。体外OA相关研究通常使用原代软骨细胞、软骨移植物或用IL-1β或TNF-α等炎症介质刺激的类软骨细胞系来模拟炎症-代谢反应[20]。SW1353细胞是一种源自人类软骨肉瘤的细胞系，已广泛用作体外类软骨细胞模型，用于研究细胞因子诱导的炎症和基质降解反应[21]、[22]、[23]。当前的治疗选项主要集中在症状缓解上，包括止痛、抗炎治疗，以及最终阶段的关节置换[8]、[13]。因此，开发能够调节OA相关分子过程的新方法具有相当重要的意义。

光生物调制（PBM），特别是在红光和近红外光谱范围内，已成为一种非侵入性治疗方法，可用于调节炎症、缓解疼痛和促进组织修复[24]、[25]。根据Tiina Karu最初提出的线粒体光感受模型，细胞色素氧化酶被认为是红光和近红外光的主要光受体之一，能够引发ATP生成、活性氧和下游细胞信号的变化[26]、[27]、[28]、[29]。在关节炎相关研究中，PBM已被报道能够抑制炎症介质的产生、减轻氧化应激并调节基质相关反应[30]、[31]、[32]、[33]、[34]、[35]。例如，红光LED照射（635纳米）减少了H₂O₂诱导的猪软骨细胞中的自由基形成和炎症基因表达[26]，而近红外激光照射抑制了IL-1β诱导的原代软骨细胞中的炎症细胞因子和NF-κB信号活性[36]、[37]、[38]。动物和临床研究还表明，PBM可以减少炎症、降低基质降解酶的活性并缓解疼痛[39]、[40]、[41]。尽管PBM在关节炎相关模型和临床研究中显示出有益效果，但照射方案仍存在很大差异。报道的PBM辐照值范围很广（大约0.04–100毫瓦/平方厘米），而能量值范围从大约0.4毫焦耳/平方厘米到60焦耳/平方厘米不等，具体取决于生物模型和治疗目标[42]、[43]、[44]。在这些参数范围内，常用的波长分布在红光到近红外范围内（大约610–930纳米），暴露时间、治疗频率和照射计划也有很大差异[24]、[26]、[32]、[36]、[42]、[43]、[44]、[45]、[46]、[47]、[48]、[49]。许多体外研究使用固定辐照度，并通过改变暴露时间或治疗频率来调整传递的能量，而对辐照度和能量密度依赖性反应的系统性比较仍然有限。此外，以前的研究主要关注选定的炎症或基质降解标志物，而与实验选择的PBM条件相关的转录组和网络级反应尚未得到充分表征。因此，通过控制变量筛选确定实验照射条件并将这一窗口与分子反应模式联系起来可能有助于阐明PBM在OA样模型中的生物学效应。

在本研究中，使用IL-1β诱导的SW1353细胞作为OA样模型，这是关节炎相关研究中常用的体外系统。选择660纳米红光是基于先前的证据，这些证据表明红光PBM在炎症中具有生物学效应，并且报告其与线粒体光受体如细胞色素氧化酶的相互作用[48]、[50]、[51]、[52]。与采用固定辐照度协议并通过照射时间调整剂量的研究不同，本研究系统地使用了控制变量方法来筛选辐照度和剂量。这一策略使得能够识别出用于后续转录组分析的可重复实验条件。然后使用细胞活力活性和代表性的炎症-代谢标志物来确定有效的660纳米PBM窗口，以便进行后续的转录组和验证分析。本研究旨在定义有效的660纳米PBM照射窗口，并提供一个转录组框架，以理解其在IL-1β诱导的SW1353细胞中对炎症-代谢反应的调节作用。

章节片段

细胞培养

人类SW1353细胞系来自中国科学院的细胞库（中国上海）。细胞培养在添加了10%胎牛血清（FBS；Excell，中国上海）和1%抗生素-抗真菌溶液（Beyotime，中国上海）的Leibovitz's L-15培养基中。细胞在无二氧化碳的湿润培养箱中维持在37°C。所有实验均使用第2代到第10代的SW1353细胞，以确保可重复性和一致性。

1% FBS培养基

控制变量参数筛选确定有效的660纳米PBM条件

基于初步的模型优化，使用10纳克/毫升的IL-1β处理48小时的SW1353细胞建立了用于后续实验的OA样炎症模型（图S1）。在OA相关的实验模型中，通常使用炎症介质和基质降解酶来评估炎症-代谢表型，其中IL6反映炎症激活，MMP13代表基质降解[54]。在这种条件下，IL-1β显著诱导了IL6和MMP13

讨论

本研究采用控制变量筛选设计来识别IL-1β诱导的OA样SW1353细胞中有效的660纳米PBM条件。PBM反应高度依赖于照射参数，包括波长、辐照度、剂量和治疗频率以及目标细胞的生物学状态[55]。PBM部分恢复了IL-1β引起的细胞活力下降，最强的反应出现在10毫瓦/平方厘米时，对应的累积能量密度为

结论

总之，通过逐步参数筛选，在IL-1β诱导的OA样SW1353细胞中，本研究确定了一种有效的660纳米PBM照射条件（5毫瓦/平方厘米，累积能量密度为18焦耳/平方厘米，分4次以12小时间隔进行）。这种条件一致地抑制了代表性的炎症和代谢标志物，同时保持了细胞活力。RNA-seq进一步显示，这种PBM方案与协调的减弱相关

CRediT作者贡献声明

肖静（Xiaojing Miao）：撰写——原始草稿、方法学、调查、概念化。任毅（Yi Ren）：撰写——审阅与编辑、形式分析。张晓琳（Xiaolin Zhang）：撰写——审阅与编辑、方法学。田静（Jing Tian）：撰写——审阅与编辑、方法学、形式分析。吴成辉（Chenghui Wu）：撰写——审阅与编辑、方法学。刘天一（Tianyi Liu）：方法学、形式分析。张旭冉（Xuran Zhang）：撰写——审阅与编辑、形式分析。刘慕清（Muqing Liu）：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了中山科学技术局的资助，授予编号为2021AG001的资助。

肖静（Xiaojing Miao）|任毅（Yi Ren）|张晓琳（Xiaolin Zhang）|田静（Jing Tian）|吴成辉（Chenghui Wu）|刘天一（Tianyi Liu）|张旭冉（Xuran Zhang）|刘慕清（Muqing Liu

复旦大学智能机器人与先进制造学院，中国上海