基于选择性富集策略的土壤中芽孢杆菌分离株生理、生化及分子特征表征

《Journal of Microbiological Methods》：Physiological, biochemical, and molecular characterization of Bacillus isolates from soils using selective enrichment strategies

　　

摘要

土壤生态系统是微生物多样性的重要储存库，具有巨大的生物技术利用潜力。在土壤微生物中，芽孢杆菌属物种因其代谢多样性、胁迫耐受能力以及生产工业相关酶和生物活性化合物的能力而尤其受到重视。本研究探讨了受控土壤预处理对微生物群落动态的影响，以及随后从突尼斯四个气候差异显著的地区（纳布勒、锡利亚纳、梅德宁和托泽尔）中分离耐应激芽孢杆菌菌株。为了选择性地富集产孢细菌，在微生物分离之前，土壤样品接受了受控热处理（40°C、60°C和80°C，各3小时）和碳酸钙改良（浓度分别为5%、10%和15%（w/w））。土壤样品的预处理显著（p < 0.05）影响了微生物数量，揭示了不同研究地点的差异性响应。共获得40个细菌分离菌株，其中15个代表性菌株进行了详细的生化、生理和分子特征鉴定。16S rRNA测序揭示了多样的芽孢杆菌分类群，包括B. velezensis、B. subtilis、B. amyloliquefaciens、Cytobacillus horneckiae，以及一个未鉴定的分离菌株Bacillus sp. 107。生理特征谱显示，分离菌株为嗜温性、中度耐盐性，并能够在中性至碱性条件下生长。这种整合方法突出了结合土壤调理和微生物分离策略的创新性。它扩展了对土壤来源芽孢杆菌多样性的理解，并产生了一批生理鲁棒的分离菌株，可作为未来功能筛选和应用导向研究的候选对象。

引言

土壤生态系统孕育着非凡多样的微生物生命，在维持土壤健康、养分循环和农业生产力方面发挥着关键作用，其中超过85%的微生物在支持植物生长方面具有有益作用（Bhavi等，2020；Silvestri等，2016）。这种丰富的微生物多样性在生态系统面临干旱、盐碱化和污染等干扰时，也在增强土壤功能的韧性和稳定性方面发挥着关键作用（Morales-Salmerón等，2025）。在土壤微生物中，芽孢杆菌属物种因其代谢多样性、生态韧性和在生物技术和可持续农业中的广泛应用潜力而引起了显著关注（Dame等，2021）。土壤是芽孢杆菌属物种的主要天然储存库，其形成内生芽孢的能力在波动的环境条件下提供了强大的选择优势。多种菌株，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、木质素芽孢杆菌等，已从世界各地的堆肥、土壤和其他环境中分离获得（Yang等，2021）。这些革兰氏阳性、杆状、可运动且形成内生芽孢的细菌能够在恶劣的环境条件下存活，并参与广泛的生态功能，包括固氮、溶磷、有机物分解以及通过产生抗菌化合物抑制土传植物病原菌（Stein，2005；Vessey，2003）。芽孢杆菌属被公认为有效的生物防治剂（BCA），其能够产生广泛的生物活性化合物，包括脂肽、细菌素、聚酮类和其他次级代谢产物，从而抑制或阻止动物或植物病原体的生长（Hellany等，2024；Wang等，2025）。

芽孢杆菌属物种被认为是极具价值的工业微生物，其生长迅速，可实现短发酵周期，并能够分泌广泛的水解酶、抗生素和胞外蛋白。来源于芽孢杆菌属的酶约占全球酶市场的50%，凸显了其作为医药、动物饲料和食品工业生产关键生物技术工具的重要性（Ammoneh等，2014；Vojnovic等，2024；Yang等，2021）。因此，分离和表征芽孢杆菌菌株对于扩大可用于未来功能性状评估和潜在应用的微生物收藏具有重要意义。在开发化学过程替代品和增强可持续发展生物解决方案的背景下，这些工作尤为重要。

尽管对土壤来源微生物的研究已相当广泛，尤其是芽孢杆菌属，但大多数研究集中于传统的直接分离方法，这些方法在应用于土壤微生物学时有显著局限性，因为它们通常只能恢复现有微生物多样性的一小部分。据估计，使用标准实验室培养基和培养条件下，不到1%的土壤微生物可被培养，主要原因是传统方法倾向于快速生长和富营养型微生物，而排除了需要特定环境信号才能生长的缓慢生长、休眠或应激适应种群。此外，优势营养体微生物可能在培养过程中压倒数量较少但功能重要的类群，导致如产孢细菌等生态相关微生物的代表性不足（Ferrari等，2005；Nichols等，2010；Pham和Kim，2012）。为了克服这些局限性，近期研究越来越多地采用选择性富集策略从自然环境中恢复目标微生物种群。例如，Reichart等（2023）选择性地从原生土壤中富集木质纤维素降解微生物，以恢复表达参与木质纤维素降解的糖苷水解酶的微生物。类似地，Wang等（2023）报道，在海洋沉积物中进行富集预处理可以通过作为选择性生态过滤器来提高可培养微生物的多样性。沿相同方向，Xie等（2026）采用热预处理富集微生物联合体以改善大体积混凝土的裂缝自愈性能，证明了热暴露抑制了热敏感微生物，同时选择性地富集了耐热的且功能上有韧性的种群。另一项近期使用优化的分离芯片（iChip）系统的研究表明，通过选择性预处理结合原位培养可以显著提高土壤产孢细菌的恢复率（Allain等，2026）。本研究引入了一种结合受控热梯度和碳酸钙改良的土壤调理策略，以选择性地富集产孢和耐应激芽孢杆菌种群。这种整合方法实现了对土壤微生物群落的定向调节，并提高了适合未来应用导向研究的韧性芽孢杆菌菌株的分离效率。

已知土壤理化性质、温度和水分可用性等因素会影响微生物群落组成，因此可能影响基于培养方法恢复的细菌多样性（Morales-Salmerón等，2025）。热处理优先消除对热敏感的营养体细胞，同时保留休眠的内生芽孢，后者在适宜的培养条件下萌发，从而增加可培养芽孢杆菌种群的相对丰度，并为产孢微生物提供选择性优势。类似地，碳酸钙（CaCO?）改良被报道可以改变土壤pH和微生物群落组成，减少真菌竞争并促进特定细菌群落的恢复，包括适应碱性或缓冲条件的产孢细菌（Guo等，2019）。综合来看，这些预处理分别通过生理耐受性和环境改造施加了互补的选择压力，因此可能比传统直接分离方法更好地恢复耐应激和功能相关的芽孢杆菌菌株。

在此背景下，本研究旨在使用整合方法——将选择性富集与生理、生化和分子特征鉴定相结合——从土壤中提取、鉴定和表征本土芽孢杆菌菌株。除了传统的分类学恢复之外，本研究强调通过对环境胁迫因子的生长响应进行评价以及分子鉴定来分离生理鲁棒且耐应激的菌株。与以往分别关注土壤生物多样性或理化性质的研究不同，本研究的创新之处在于在细菌分离之前应用热处理和碳酸钙改良，以选择性地调节土壤微生物群落，并富集在使用传统培养方法下可能代表性不足的产孢和耐应激芽孢杆菌种群。这种整合策略扩展了对土壤来源芽孢杆菌多样性的理解，并产生了一批可作为未来功能筛选和应用导向研究候选对象的分离菌株。

基于芽孢杆菌属物种的生态韧性和形成内生芽孢的能力，我们假设：(i) 热处理和碳酸钙改良将通过选择性地偏好抗性微生物来差异性富集产孢和耐应激芽孢杆菌种群；(ii) 来源于不同气候和环境条件的芽孢杆菌将表现出不同的生理和生化特征，反映对其原生栖息地的适应；(iii) 与传统的直接分离方法相比，联合预处理策略将增加耐应激和产孢芽孢杆菌菌株的多样性和恢复效率。这些假设为评估所提出的分离策略的有效性以及解释恢复菌株的功能多样性提供了概念框架。

片段章节

化学试剂

本研究中使用的所有化学试剂均为分析纯。碳酸钙（CaCO?）、氯化钠（NaCl）、乙醇、甘油和革兰氏碘液购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。酵母提取物、麦芽提取物、葡萄糖、利福平、制霉菌素、琼脂、营养琼脂（NA）、营养肉汤（NB）、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、淀粉酪素琼脂培养基（SCAM）和国际链霉菌项目（ISP）培养基购自HiMedia Laboratories Pvt. Ltd.（印度孟买）。

理化性质

所选土壤样品对关键理化参数进行了分析，结果如图2所示。热处理显著（p < 0.05）改变了纳布勒、锡利亚纳、梅德宁和托泽尔土壤的理化性质（图2），突显了不同地区对非生物胁迫的区域特异性响应。电导率（EC）、pH和水分含量受到影响尤为显著，反映了热暴露后离子组成、矿物平衡和土壤结构的变化。

结论

本研究证明，选择性热预处理可以有效地从气候差异显著的突尼斯地区土壤中富集可培养的产孢细菌。60°C的热处理，以及在锡利亚纳土壤中的40°C处理，有效地富集了耐应激、产孢的芽孢杆菌种群，同时限制了非目标微生物。碳酸钙改良通常对微生物生长产生抑制作用，在所描述条件下并未提高分离效率。

生成式AI和AI辅助技术声明

在本工作的准备过程中，作者仅使用AI辅助工具来提高语言、语法、拼写和可读性。在使用这些工具后，作者对内容进行了审查和必要的编辑，并对手稿内容承担全部责任。未使用生成式AI或AI辅助技术来生成或修改图形、艺术品、图表、图形摘要、补充信息、科学内容、数据分析、解释或参考文献。

CRediT作者贡献声明

Narjes Harrazi：撰写——原稿、验证、软件、方法论、调查、形式分析、概念化。Imen Zaghbib：撰写——审阅与编辑、可视化、验证、监督、软件、方法论、调查、数据管理、概念化。Johar Amin Ahmed Abdullah：撰写——审阅与编辑、软件、形式分析、数据管理。Fernando Pérez-Rodríguez：撰写——审阅与编辑、验证、资源、形式分析。Luis M. Medina：撰写——

利益冲突声明

作者声明无利益冲突。

致谢

衷心感谢科尔多瓦大学食品科学与技术系、ENZOEM以及动物源性传染病与新发病害竞争性研究单位在本研究工作中提供的宝贵支持和协作。他们的指导、技术协助和资源提供是成功完成本研究的基本要素。

Narjes Harrazi | Imen Zaghbib | Johar Amin Ahmed Abdullah | Fernando Pérez-Rodríguez | Luis M. Medina | Mnasser Hassouna

研究实验室"技术创新与粮食安全-LR22 AGR01"，突尼斯食品工业高等学院（ESIAT），迦太基大学，突尼斯 1002，突尼斯