基于明胶膜采样基质的空气传播呼吸道病毒标准化定量RT-qPCR检测工作流程验证研究

《Journal of Microbiological Methods》：Validation of a standardized quantitative RT-qPCR workflow for detection and quantification of airborne respiratory viruses using gelatin membranes as sampling matrix

　　

空气微生物监测在识别和定量病毒病原体方面日益重要；然而，针对从环境基质中回收的呼吸道病毒的标准化分析工作流程仍然有限。本研究报道了一种定量逆转录聚合酶链反应（quantitative RT-qPCR）工作流程的完整分析验证，该流程用于从明胶膜过滤器采集的空气样本中同时检测和定量SARS-CoV-2、流感A型病毒、流感B型病毒和呼吸道合胞病毒A/B（RSV A/B）。该方案优化了来自这一挑战性基质的RNA提取和扩增步骤，并提供了一套适用于可重复实验室实施的标准化程序。所有验证参数——扩增效率、线性、回收率、基质干扰、检测限（limit of detection, LOD）、定量限（limit of quantification, LOQ）、重复性和再现性——均依据ISO 20395和定量实时PCR实验发表最低信息（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments, MIQE）指南进行评估，且均满足所有预设接受标准。该工作流程表现出优异的线性（所有靶标的R²≥0.99）、高扩增效率（92–103%）、稳健的回收率（81.98–92.28%）以及无显著基质干扰（±10%）。LOD范围为每反应5至9拷贝，LOQ范围为每反应8至10.5拷贝。精密度评估证明了可接受的批内和批间变异性（变异系数CV%≤35%，标准差SD<0.19）。总体而言，这一经过验证且符合标准规范的RT-qPCR工作流程为实验室定量分析明胶膜过滤器采集的空气传播呼吸道病毒提供了可靠、灵敏且可重复的分析工具，支持气溶胶样本的标准化病毒学分析。

**研究背景与现存问题**

空气传播病原体（如流感病毒、冠状病毒和呼吸道合胞病毒）的检测与定量在方法学上存在显著挑战。尽管明胶膜过滤器在捕获空气传播病毒方面具有高效率和实用性，但其作为一种非标准基质，无法被常规核酸提取试剂盒直接处理，给病毒基因组回收带来了独特困难。当前领域缺乏统一的标准化方案和验证标准，导致不同实验室间的数据可比性和可重复性严重受限。已有RT-qPCR方案多针对临床样本（如鼻咽拭子、痰液）开发验证，尚未系统验证其在明胶膜采集的空气样本中的适用性。针对空气样本检测的定量RT-qPCR工作流程的验证参数（如检测限LOD、定量限LOQ、线性、精密度、准确度和基质效应）表征不足。为解决上述问题，本研究旨在开发和验证一套符合ISO 20395和MIQE指南的综合性分析流程，用于空气样本中多种呼吸道病毒（SARS-CoV-2、流感A/B、RSV A/B）的同时检测与定量，系统评估膜处理与核酸提取等前分析变量，并全面检验灵敏度、特异度、线性、精密度和准确度等分析性能。

**研究内容与主要结论**

研究人员开发并全面验证了一套整合明胶膜过滤采样、优化病毒RNA提取和多重复合定量RT-qPCR的分析流程。所有验证参数均满足预设接受标准：回收率为81.98%–92.28%，无显著基质干扰（±10%内），LOD为每反应5–9拷贝，LOQ为每反应8–10.5拷贝，批内与批间精密度均符合要求（CV%≤35%，SD<0.19），扩增效率92%–103%，线性R²≥0.99。该工作流程为空气传播呼吸道病毒的标准化定量检测提供了可靠、灵敏且可重复的分析工具，有力支持环境病毒学监测和公共卫生决策。

**主要关键技术方法**

研究人员采用的主要技术方法包括：使用AcroMetrix?多分析物对照品（10,000拷贝/mL）和Meyer儿童医院IRCCS提供的SARS-CoV-2、RSV A/B现场毒株及实验与临床医学系微生物与病毒学实验室提供的Flu A/B毒株作为参考材料；将已知量靶标加标至明胶膜以模拟真实样本；采用经优化的PureLink? RNA Mini Kit提取RNA（增加裂解缓冲液体积至250μL并增设洗涤步骤）；使用TrueMark? SARS-CoV-2、Flu A、Flu B、RSV A/B Select Panel在QuantStudio 5热循环仪上进行多重RT-qPCR扩增；通过标准曲线进行绝对定量，并依据ISO 20395和MIQE指南系统评估回收率、基质干扰、LOD/LOQ、精密度、扩增效率和线性等验证参数。

**研究结果**

**回收率（Recovery）**

通过三个浓度水平的加标实验，研究人员评估了各靶标病毒的提取回收率。SARS-CoV-2总体回收率为92.18%（范围87.17%–101.89%），Flu A平均回收率82.25%，Flu B平均回收率92.28%，RSV A/B总体回收率81.98%。结果表明该方法对各病原体均具备稳健且一致的提取和定量效率。

**基质干扰（Matrix interference）**

研究将多分析物对照品加标至明胶膜空白提取物中进行检测，设置三种实验条件对比。结果显示，所有靶标病毒在基质空白加标样本中检测到的拷贝数均处于单独对照品与单独基质空白理论加和的±10%范围内，证实明胶膜基质对PCR扩增和分析无显著干扰。

**检测限（LOD）与定量限（LOQ）**

通过5个梯度稀释度和5个重复的系列实验，确定了各靶标的LOD和LOQ。SARS-CoV-2具有最低的LOD（每反应5拷贝）和LOQ（每反应10.5拷贝，CV%为25%）；Flu A的LOD和LOQ均为每反应8.5拷贝（CV%为24%）；Flu B的LOD和LOQ均为每反应8拷贝（CV%为29%）；RSV A/B的LOD和LOQ均为每反应9拷贝（CV%为34%），均满足预设接受标准。

**精密度（重复性与再现性）**

批内精密度评估显示，所有靶标和浓度水平的log₁₀拷贝数SD范围为0.025–0.077，远低于0.19的接受阈值；Ct值CV%介于6%–17%。批间精密度评估中，SD范围为0.069–0.117，CV%范围为16%–26%（RSV A/B在最低浓度水平时最高为25%），均符合预设接受标准，表明该方法具有优良的重复性和日间再现性。

**扩增效率（Amplification efficiency）**

基于系列稀释的定量病毒株建立标准曲线，所有靶标的斜率均处于?3.6至?3.1的接受范围（SARS-CoV-2为?3.526，Flu A为?3.258，Flu B为?3.297，RSV A/B为?3.299），效率介于92%至103%之间（90%–110%为可接受范围），R²均≥0.99，证实各靶标的扩增性能最佳。

**线性（Linearity）**

线性回归分析显示，所有靶标的回归线斜率均为1.000，与理想值完全一致；R²均≥0.99；截距介于0.000至0.004之间，接近零，表明在测试浓度范围内预期拷贝数与实测拷贝数间存在完美比例关系，无显著系统误差。

**讨论与结论**

研究人员指出，以往空气传播病毒研究多集中于检测可行性验证，而对过滤介质相关基质效应和回收率的正式分析验证评估不足。本研究提供了首批依据ISO 20395和MIQE指南对明胶膜采集的多种呼吸道病毒进行的全面分析验证之一，填补了该方法学空白。RSV在低浓度下表现出较其他靶标更高的变异性，研究人员认为这与商业试剂盒同时检测遗传差异较大的RSV-A和RSV-B两种亚型，序列变异性可能影响引物/探针结合有关。研究亦承认其单实验室、单一提取试剂盒和单一PCR平台的局限性，未来需要通过跨实验室和跨平台研究进一步确认其广泛适用性。

研究结论为：本研究提供了一种用于空气样本中呼吸道病毒检测和定量的定量多重RT-qPCR方法的全面验证。该方法满足国际公认的ISO 20395和MIQE接受标准，证实了其可靠性和可重复性。膜处理、RNA提取和扩增步骤的优化产生了一套一致且准确的工作流程，能够生成流行病学监测和生物风险评估所必需的定量数据。与以往大多数仅关注定性检测的方法不同，本工作提供了一套全面验证的、符合ISO/MIQE标准的定量工作流程，用于从明胶空气样本中检测SARS-CoV-2、流感A/B和RSV A/B。通过提供可重复和定量的结果，该方法代表了技术上的进步，也实际推动了空气传播病毒监测统一方案的确立。