2-乙基己基水杨酸通过氧化应激诱发发育毒性：基于计算机预测、果蝇实验和AOP框架的发现

《Journal of Hazardous Materials》：2-Ethylhexyl salicylate Induces Developmental Toxicity Through Oxidative Stress: Insights from In Silico Prediction, Drosophila Experiments and AOP Framework

　　摘要：2-乙基己基水杨酸酯（EHS）是一种常见的有机紫外线过滤剂，广泛用于个人护理和工业产品中。它通过皮肤接触和环境排放进入人体和生态系统，引发了对其长期发育毒性的担忧。本研究结合了网络毒理学、黑腹果蝇实验、剂量依赖性转录组学以及不良后果路径（AOP）框架，来探究EHS诱导的发育毒性机制。网络毒理学发现了168个潜在靶点和11个核心基因，这些基因的富集表明与氧化应激相关过程及PI3K/AKT信号通路有关。分子对接实验确认了EHS与这些核心蛋白的稳定结合。母体暴露于EHS会显著降低后代的蛹数和羽化率，表明存在发育毒性。此外，成年果蝇暴露于EHS后表现出体重下降、甘油三酯水平降低、超氧化物歧化酶活性降低以及攀爬能力减弱，同时过氧化氢酶活性和丙二醛含量增加。N-乙酰半胱氨酸救援实验进一步验证了氧化应激在EHS诱导毒性中的关键作用。基于剂量依赖性转录组学分析，构建了一个不良后果路径（AOP），该路径以活性氧（ROS）的产生为分子起始事件，进而导致 lipid 过氧化、线粒体功能障碍和 DNA 损伤，最终引发发育毒性。MAPK 和 PI3K/AKT 信号通路可能在这过程中起关键作用。本研究揭示了 EHS 的发育毒性机制，并支持了对其风险的评估。

引言：有机紫外线过滤剂（OUVFs）不仅是个人护理产品（PCPs）中的核心活性成分，用于减轻紫外线（UV）辐射造成的皮肤损伤，还在食品包装、纺织品和涂料中发挥重要作用，以延缓产品降解[1]。在这些紫外线过滤剂中，2-乙基己基水杨酸酯（EHS）作为一种水杨酸类 UVB 吸收剂，在商业配方中应用最为广泛[2]。据报道，在中国市场上销售的六类个人护理产品中，EHS 的浓度中位数为 109 ng/g[3]。由于其大量且持续的使用，EHS 已在各种环境介质中被检测到，包括地表水[4]、海水[5][6]、废水[7]、沉积物[8]和城市空气[9]。值得注意的是，在 Adriatic 海岸水域，娱乐活动高峰期间 EHS 浓度可达到 10,900 ng/L[6]。由于其高脂溶性，EHS 容易在生物体内积累，并通过食物链进一步放大[10]。不同物种的生物累积因子（BAF）范围为 648 至 2310 L/kg，平均值为 1432 L/kg，营养放大因子（TMF）为 1.66[11]。在中国检测的八种复合食品样品中，EHS 占比最高（34.1%），总浓度范围为 1.5 至 68.3 ng/g[12]。一项使用德国人群 24 小时尿液样本的人体生物监测研究表明，过去二十年 EHS 暴露量呈持续上升趋势，计算出的最大每日摄入量（EDI）为 59 μg/(kg bw·d)[13]。此外，EHS 也在其他人体样本中检出，如母乳、精液和胎盘，这可能导致发育中的胎儿过早暴露于 EHS[14]。在美国儿童日托设施的人类健康风险评估中，EHS 被列为五种最具毒性的挥发性有机化合物（VOCs）之一[15]。综上所述，迫切需要评估 EHS 对人类的潜在发育毒性影响。

目前关于 EHS 的发育毒性研究主要集中在水生生物上。研究表明，EHS 会干扰海洋桡足类动物（Acartia tonsa）的进食行为和生殖功能[16]。EHS 可能会引起亲代斑马鱼及其后代的生长和发育毒性、氧化应激以及甲状腺毒性[14]。使用斑马鱼胚胎进行的沉积物暴露实验表明，EHS 暴露后胚胎-幼体阶段的心率显著升高[17]。另一项研究阐明 EHS 通过干扰脂质代谢导致斑马鱼胚胎心血管发育异常[18]。斑马鱼研究进一步表明，氧化应激和脂质代谢可能是 EHS 诱导发育毒性的关键因素[19]。尽管许多研究已经记录了 EHS 对水生生物的潜在发育毒性，但仍需更全面地研究 EHS 诱导发育毒性的潜在靶点和机制。传统毒理学往往关注单一靶点或终点，难以系统地阐明复杂的毒性机制[20]。网络毒理学是一种新兴方法，从整体角度分析化合物、靶点和通路之间的相互作用，有助于有效识别关键调控网络和潜在的毒性机制[21]。分子对接可以预测化学化合物与生物靶点之间的结合模式和亲和力，为网络毒理学研究提供分子层面的结构证据[22]。然而，计算预测不可避免地存在假阳性风险，应通过实验验证进行补充[23]。组学技术，尤其是转录组学，可以通过捕获全基因组的分子反应来帮助解决这一局限性[24][25]。此外，剂量依赖性转录组分析可以定量描述不同暴露梯度下的基因表达模式，并推导出基准剂量（BMD）值，大大提高毒性评估的可靠性[26][27]。为了进一步整合这些多层次数据，并建立分子变化与不良表型之间的明确联系，本研究整合了不良后果路径（AOP）框架，将组学数据直接与毒理学相关的表型事件联系起来，从而实现对化学风险的更全面和准确的评估[28]。

本研究采用网络毒理学方法探究 EHS 诱导的发育毒性机制，并通过黑腹果蝇（以下简称果蝇）暴露实验验证了 EHS 的关键毒性机制，这种实验可以模拟真实的暴露途径，如饮食和皮肤接触[29][30]。该方法结合了剂量依赖性转录组学和不良后果路径（AOP）框架的构建，以全面验证毒性机制（图 1）。本研究的目标是：（1）识别 EHS 诱导发育毒性的关键靶点和机制；（2）利用果蝇暴露实验和剂量依赖性转录组学确认 EHS 诱导的保守机制；（3）通过构建不良后果路径（AOP）阐明从早期暴露到最终不良结果的完整毒性过程。我们的研究不仅提供了关于 EHS 诱导发育毒性潜在分子机制的新见解，还证明了将网络毒理学分析与剂量依赖性转录组学相结合在阐明化学物质毒性机制方面的有效性。

EHST 靶点的收集：EHS 的分子结构以 Structure-Data File (SDF) 格式以及 Simplified Molecular-Input Line-Entry System (SMILES) 格式从 PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）获取。为了预测 EHS 的潜在蛋白质靶点，数据从 STITCH（https://stitch.embl.de/）、ChEMBL（https://www.ebi.ac.uk/chembl/）、SwissTargetPrediction（https://swisstargetprediction.ch/）、PharmMapper（https://www.lilabecust.cn/pharmmapper/index.html）收集并整合。

通过将来自 STITCH、ChEMBL、SwissTargetPrediction、PharmMapper 和 Targetnet 的 243 个 EHS 靶点与 OMIM、TTD 和 GeneCards 中的 5009 个与发育毒性相关的靶点进行交集分析，我们确定了 168 个潜在的 EHS 诱导发育毒性靶点（图 2A）。使用 STRING 数据库构建了一个全面的蛋白质相互作用网络（PPI），并使用 Cytoscape 软件进一步分析各个节点的拓扑特性。

结论：作为个人护理和工业产品中最广泛使用的紫外线过滤剂之一，EHS 对人类生长发育构成威胁。本研究利用网络毒理学预测了 EHS 诱导发育毒性的潜在靶点。通过多种算法共识别出 11 个核心基因，包括 AKT1、ALB、CASP3、EGFR、ESR1、GSK3B、HSP90AA1、MAPK1、MMP9、PPARG 和 SRC。分子对接结果进一步确认 EHS 可以与这些核心基因稳定结合。

环境影响：作为一种广泛使用的紫外线过滤剂，EHS 通过环境迁移和皮肤接触对生物体和人类具有潜在的发育毒性。通过将计算机预测、果蝇实验和不良后果路径（AOP）构建相结合，本研究揭示了 EHS 诱导的发育毒性涉及氧化应激以及 MAPK 和 PI3K/AKT 通路的改变。这种整合方法为紫外线过滤剂的毒性研究提供了可靠的研究框架，支持其环境风险评估和安全评估。

作者贡献声明：Yina Xu：验证、研究。Yifei Guo：撰写 - 审稿与编辑。Yujia Pang：验证、研究。Zhangyan Ji：验证、研究。Miao Guan：撰写 - 审稿与编辑、监督、软件、项目管理、方法学、资金获取、数据管理、概念化。Linhao Zong：撰写 - 审稿与编辑、监督、软件、方法学、研究、概念化。Fei Ma：撰写 - 审稿与编辑、监督。Qiuxia Zhang：撰写。

作者声明：他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的研究。

致谢：本研究由中国国家自然科学基金（项目编号 42207324）资助。

江苏师范大学生命科学学院生物多样性与生物技术重点实验室，江苏省南京市文苑路 1 号，210023，中国。