欧洲榛（Corylus avellana L.）中一个SAD基因簇的基因型和转录组特征

《Journal of Agriculture and Food Research》：Genotypic and transcriptomic characterization of a SAD gene cluster in European hazelnut ( Corylus avellana L.)

　　

欧洲榛（Corylus avellana L.）是一种坚果作物，其果仁富含不饱和脂肪酸，这一特征在该物种中迄今仅从遗传学角度得到少量研究。在当前工作中，研究人员利用40,113个单核苷酸多态性（SNPs），对一个由89个个体组成的多样性群体进行了榛子果仁脂肪酸含量的初步全基因组关联研究（GWAS）。该分析报告了分别与花生酸（C20:0）和亚油酸（C18:2Δ9,12）显著相关的5个和6个SNP标记-性状关联。在4号染色体上，一个与花生酸显著关联（p value = 2.86 x 10-11）的SNP位于一个包含7个推定编码硬脂酰-[酰基载体蛋白]（ACP）Δ9-脱饱和酶（SAD）基因模型的基因簇附近，该酶在植物中负责在C18脂肪酸中引入第一个双键。作为平行策略，研究人员对该物种参考基因组中的脂肪酸脱饱和酶（FADs）进行了全基因组鉴定，共鉴定出属于该基因家族的27个成员。欧洲榛与其他壳斗目（Fagales）物种之间的比较基因组学分析表明，除波斯核桃（Juglans regia L.）外，其他所分析物种中均存在SAD基因簇。最后，研究人员对盆栽（in vivo）和组织培养（in vitro）两种生长条件下的植株叶片、叶柄、节、节间和根等营养器官中的FAD基因表达谱进行了表征。研究人员观察到FAD基因旁系同源物在不同器官间的表达模式存在差异，而两种生长系统之间的转录谱总体保持保守。在成簇排列的SAD基因中，CaSAD.9（LOC132177089）在两种生长系统植株的所有器官中均表现出高表达水平[log2(TPM+1) ≥ 6.83]。

欧洲榛SAD基因簇的基因型与转录组特征研究解读

一、研究背景与科学问题

欧洲榛（Corylus avellana L.）属于桦木科（Betulaceae）壳斗目（Fagales），是全球广泛栽培的重要坚果作物之一，其果实因风味独特和高营养价值而备受青睐，超过90%的产量被食品工业尤其是糖果制造业所利用。榛子消费与抗动脉粥样硬化效应、降低心血管疾病风险以及缓解神经退行性疾病风险等健康益处相关联。这种有益潜力反映了榛子丰富而均衡的化学组成，包括大量的矿物质、维生素、纤维、蛋白质和脂肪，其中脂肪占果仁重量的60%。在脂类化合物中，单不饱和脂肪酸（MUFAs）占比最高，油酸占果仁总脂肪酸的75-80%；多不饱和脂肪酸（PUFAs）主要以亚油酸为代表，含量在7-14%之间；饱和脂肪酸含量较低，棕榈酸和硬脂酸分别占5-7%和1.6-3%。多年来的研究表明，不同栽培品种间脂肪酸组成存在高度变异，提示该性状受强烈的基因型影响。

尽管脂肪酸是榛子果仁的重要组成成分，但与该物种中此类化合物代谢相关的遗传基础研究一直被忽视，这与油棕、橄榄、澳洲坚果和核桃等其他油料树木作物的情况形成对比。由于不饱和脂肪酸是榛子中此类化合物最显著的部分，脂肪酸脱饱和酶（FADs）发挥着关键作用。FADs是一类加氧酶，催化从脂肪酰链上移除两个氢原子以引入碳-碳双键，以分子氧为辅因子。这些酶可分为两个结构上不相关的组：可溶性酶和膜结合酶。第一组以硬脂酰-ACP Δ9-脱饱和酶（SADs）为代表，位于质体基质中，通过在C-9和C-10之间引入双键，将硬脂酰-ACP（C18:0）转化为油酰-ACP（C18:1Δ⁹）。膜结合FADs包括多个成员，进一步分为多个亚家族。此外，欧洲榛与其他壳斗目物种一样，对in vitro组织培养表现出明显的顽拗性，这阻碍了遗传工程技术在功能基因组学研究和育种中的应用。

基于上述背景，本研究旨在通过全基因组关联分析（GWAS）探究SNP与榛子果仁中10种脂肪酸浓度之间的关联，对FAD基因进行全基因组鉴定，开展壳斗目物种间多个SAD基因的比较分析，并通过转录组测序分析FAD基因在营养器官中的表达谱。该研究发表于《Journal of Agriculture and Food Research》。

二、主要关键技术方法

研究人员使用了以下关键技术方法：对158个基因型（包括156个欧洲榛品种、1个Corylus avellana var. contorta野生型个体和1个土耳其榛（Corylus colurna L.）野生型个体）进行ddRAD基因分型测序，比对至‘Tombul’参考基因组后经系列过滤获得40,113个高质量SNPs；对89个同时具有基因型和表型数据的基因型子集，采用FarmCPU模型（固定和随机模型循环概率统一法）结合3个主成分进行GWAS分析；利用Plink计算各染色体连锁不平衡（LD）衰减；通过扫描InterPro结构域并结合BLAST方法鉴定FAD基因家族成员；采用最大似然法构建系统发育树；利用MCScanX进行种内和种间共线性分析；对‘Tonda Gentile Romana’品种盆栽（in vivo）和组织培养（in vitro）来源植株的叶片、叶柄、节、节间和根进行Nanopore转录组测序，以NanoCount定量基因表达，并使用DESeq2进行差异表达分析。

三、研究结果

3.1 榛子果仁脂肪酸含量的全基因组关联研究

经筛选后，来自146个基因型的40,113个高质量SNPs用于LD分析和LD衰减估计。在研究的10个性状中，仅棕榈酸、异油酸和α-亚麻酸呈正态分布。多数性状与其他至少一个性状存在显著相关性，油酸与亚油酸呈最强负相关（Spearman's ρ = -0.96），棕榈油酸与异油酸呈最强正相关（Spearman's ρ = 0.80）。GWAS分析鉴定出6个与亚油酸相关的SNPs（分布于1、2、4、5、8和11号染色体）和5个与花生酸相关的SNPs（1、2、7号染色体各1个，4号染色体2个）。LD衰减值范围为11号染色体上的128,606 bp至3号染色体上的416,335 bp。与花生酸相关的SNPs的表型方差解释率（PVE）普遍较低（低于4%），仅7号染色体上的SNP例外，达33.25%；与亚油酸相关的SNPs的PVE也均低于2%，仅2号和11号染色体上的SNPs分别达11.34%和11.74%。GO富集分析显示，与脂肪酸代谢相关的类别显著富集，包括“脂肪酸代谢过程”（GO:0006631）和“硬脂酰-[ACP]脱饱和酶活性”（GO:0045300）。在LD区域内鉴定出多个与脂肪酸代谢相关的候选基因，其中CaSAD.2与2号染色体上亚油酸相关SNP处于LD，CaSAD.3、CaSAD.4、CaSAD.5和CaSAD.6与4号染色体22,707,256位点处花生酸相关SNP处于LD。

3.2 FADs的全基因组鉴定、结构和系统发育分析

在‘Tombul’参考基因组中，23个基因被注释为与脂肪酸脱饱和相关的InterPro类别，另有4个基因被鉴定为FAD4，共27个成员，分布于除5、8和11号染色体外的所有染色体。其中SAD亚家族成员最多，共11个（CaSAD.1-CaSAD.11）。CaSAD.3、CaSAD.4和CaSAD.5以及CaSAD.7、CaSAD.8和CaSAD.9在4号染色体上以串联重复方式排列，连同CaSAD.6形成一个约220 kb的基因簇。Δ12 FAD亚家族有5个成员，其中CaFAD6预测编码叶绿体酶，CaFAD2.1-CaFAD2.4编码微粒体酶。Δ15 FAD亚家族包含CaFAD3、CaFAD7/8.1和CaFAD7/8.2，均为片段重复事件的产物。FAD4基因有4个拷贝。系统发育分析清晰地将质体可溶性酶与膜结合酶分开，同一亚家族成员聚在一起。保守基序分析显示同一亚家族成员间序列同源性高度保守。所有SAD基因具有3或4个外显子（CaSAD.10除外，仅2个外显子）。膜结合FADs的特征性结构域——组氨酸盒的分析显示，同一亚家族成员间序列高度保守，但不同成员间组氨酸盒数量存在差异。

3.3 壳斗目SAD基因簇的共线性分析和系统发育分析**

对壳斗目各物种中SAD基因分布的分析揭示了这些物种中SAD基因簇的存在和组织方式的差异。欧洲榛4号染色体上的基因簇跨越221,674 bp（位置22,873,162至23,094,836），包含7个SAD基因（CaSAD.3-CaSAD.9）和2个假基因。欧洲栗4号染色体上的基因簇跨越266,559 bp，包含6个SAD基因和5个假基因。谷栎10号染色体上存在一个203,693 bp的基因簇，包含6个SAD基因和4个假基因。欧洲桤木1号染色体上存在一个216,411 bp的区域，包含6个SAD基因。美洲山核桃1号染色体上观察到2个紧密相连的SAD基因，距第3个基因约250 kb。与山核桃不同，在波斯核桃的直系同源区域未观察到3个或更多SAD基因的排列，仅鉴定到2个SAD基因。共线性分析显示欧洲榛与其他壳斗目物种间在SAD基因簇侧翼区域存在共线性区块。系统发育分析显示，山核桃和波斯核桃中这些基因编码的序列与CaSAD.9具有更高的序列同源性，形成一个也包含CsSAD.2、QlSAD.10、AgSAD.6的簇，这些均由位于各自SAD基因簇边界的基因编码。

3.4 in vivo和in vitro生长植株中FAD基因的表达谱和差异表达分析**

共有20个FAD基因在in vivo生长植株的器官中表达，其中仅16个在in vitro来源植株中也有表达。两种生长系统中的表达谱均形成两个明显的大簇。高表达基因簇在in vivo条件下包括CaFAD2.1、CaSAD.10、CaSLD.1、CaSLD.2、CaFAD6和CaFAD7/8.2，在in vitro条件下除CaFAD7/8.2外这些基因也形成独立簇。CaSAD.2和CaDES在两种生长系统中表现出相似表达模式。LRT和Wald检验鉴定出多个基因在不同器官间存在显著差异表达，如CaFAD6、CaFAD7/8.1、CaFAD7/8.2、CaSAD.8、CaFAD4.2等。CaSAD.3、CaSAD.4-1、CaSAD.4-2、CaSAD.1和CaFAD2.3仅在in vivo生长植株的少数器官转录组中检测到，表达水平从未超过2.65 log₂(TPM+1)。

四、讨论与结论

本研究中使用的多样性群体个体数相对较少（89个），可能降低了分析的统计功效，因此仅对少数性状鉴定出显著关联标记。2号染色体10,986,120位点处的SNP与亚油酸含量相关，该标记与47个基因处于LD，其中CaSAD.2编码硬脂酰-[ACP] Δ9-脱饱和酶，该酶催化C18:0向C18:1Δ⁹的转化，是不饱和脂肪酸合成中的第一个脱饱和步骤和限速步骤。4号染色体22,707,256位点处与花生酸相关的SNP的LD区域内包含4个编码SAD的基因（CaSAD.3-CaSAD.6）。尽管酰基-ACP脱饱和酶不直接参与花生酸的生物合成，但脂肪酸间观察到的强相关性（硬脂酸与花生酸呈正相关，Spearman's ρ = 0.64）与脂肪酸生物合成的相互关联性一致，即一种脂肪酸合成中酶活性的变化可影响同一代谢途径衍生其他脂肪酸的积累。硬脂酸-ACP脱饱和酶催化质体中C18:0-ACP向C18:1-ACP的脱饱和，其活性变异可能影响硬脂酸在脱饱和与替代代谢途径之间的分配，未被脱饱和的硬脂酸可能进入从质体输出的脂肪酸池，随后被活化为酰基-CoA，进入内质网中的超长链脂肪酸生物合成途径。

综上所述，本研究通过GWAS在榛子中鉴定出与亚油酸和花生酸含量相关的SNP标记，并在4号染色体上发现了一个包含7个SAD基因的基因簇与该性状相关联。全基因组鉴定共获得27个FAD基因家族成员，比较基因组学分析表明SAD基因簇存在于除波斯核桃外的其他壳斗目物种中。转录组分析揭示了FAD基因在不同营养器官中的差异表达模式，其中CaSAD.9在所有器官中均表现出高表达水平。这些发现为理解榛子脂肪酸代谢的遗传调控机制提供了重要基础，对旨在改善该物种脂肪酸组成和平衡的选择育种计划具有潜在的应用价值。