整合素β3的α2,6-唾液酸化由唾液酸转移酶ST6Gal1催化促进人巨细胞病毒进入成纤维细胞

《Virulence》：Integrin β3 α2,6-sialylation by the sialyltransferase ST6Gal1 promotes human cytomegalovirus entry into fibroblasts

　　

病毒配体与细胞受体之间的相互作用，以及随后人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）进入宿主细胞，是病毒—宿主关系研究中的重要焦点。本研究探讨了成纤维细胞感染早期整合素β3（Integrin β3）的α2,6-唾液酸化功能及其机制作用。对整合素β3糖组学数据库的分析显示，整合素β3表面聚糖被广泛修饰末端唾液酸（sialic acid，SA）残基，且丰度较高。为评估其功能相关性，研究人员建立了整合素β3敲除细胞与α2,6-唾液酸转移酶ST6Gal1敲低细胞。定量PCR、流式细胞术和免疫荧光分析证实，整合素β3的α2,6-唾液酸化是病毒内化所必需的，该修饰缺失会显著降低病毒进入宿主细胞。该现象通过其他检测病毒感染的病毒学实验得到进一步验证。机制分析表明，整合素β3的α2,6-唾液酸化缺陷会损害病毒受体与配体相互作用，阻止病毒进入信号通路Integrin-Src激活，并导致HCMV诱导的RhoA-cofilin失活受损。这些发现拓宽了对HCMV早期感染的认识，并突出ST6Gal1与整合素β3 α2,6-唾液酸化可作为治疗干预的糖生物学靶点。

论文解读：《Virulence》发表研究揭示整合素β3 α2,6-唾液酸化促进HCMV进入成纤维细胞

研究背景与立项依据

人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）属β-疱疹病毒，全球血清阳性率高，在免疫低下人群可致严重疾病，现有疗法受效力和毒性限制。HCMV在成纤维细胞中以裂解感染为主，早期依赖病毒配体与特异性受体相互作用；已知关键受体包括整合素β3（Integrin β3）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）和血小板源性生长因子受体α（platelet-derived growth factor receptor α，PDGFRα）。整合素β3可结合病毒糖蛋白三聚体并激活Integrin β3-Src、RhoA-cofilin等信号通路，驱动细胞骨架重排以促进病毒进入。既往研究提示整合素β3的N-和O-糖基化位点与HCMV内吞有关，但其表面具体糖链结构在病毒进入中的作用不清楚。宿主受体糖基化可调控病毒附着与进入，因此研究人员开展本研究，明确整合素β3表面α2,6-连接唾液酸（α2,6-linked sialic acid，α2,6-SA）在早期HCMV感染中的功能与机制，并评估ST6Gal1作为干预靶点的潜力。

主要技术方法概览

研究人员使用已公开整合素β3高分辨液相色谱—串联质谱（LC-MS/MS）糖组学数据集分析N-和O-聚糖组成与相对丰度；以MRC-5人肺成纤维细胞为对象，构建整合素β3敲除细胞与ST6Gal1敲低/回补模型；用神经氨酸酶处理重组整合素β3去除唾液酸；通过Sambucus nigra凝集素（SNA）印迹检测α2,6-SA；以qPCR、流式细胞术、免疫荧光评估病毒附着与内吞；用改良ELISA和免疫共沉淀（co-IP）分析整合素β3与HCMV糖蛋白H（gH）结合；以Western blot检测Integrin-Src、Paxillin、Cofilin通路，用RhoA活化试剂盒和F-actin/phalloidin成像分析细胞骨架重排；并以细胞病变效应（CPE）、立即早期（immediate-early，IE）蛋白、病毒DNA拷贝和TCID₅₀评价感染与子代病毒产生。

研究结果

Glycan structures and relative abundance of Integrin β3 N- and O-glycans

研究人员通过整合素β3糖组学数据分析发现，N-聚糖以二天线结构为主，N125、N346、N585位点二天线比例高，N397以高甘露糖为主，N680含较多岩藻糖；O-聚糖中唾液酸化占31.47%，岩藻糖化占70.70%；总糖形中A2S1G1最丰富，说明整合素β3表面末端唾液酸广泛存在，为研究α2,6-SA功能提供依据。

Reduced Integrin β3 α2,6-sialylation resulted in an impairment in HCMV entry

研究人员通过ST6Gal1敲低、整合素β3敲除及cDNA回补实验，结合qPCR、流式细胞术和免疫荧光检测病毒附着与内吞。结果显示各组长病毒附着无显著差异，但ST6Gal1敲低使细胞内病毒DNA和pp28内吞信号明显下降，回补ST6Gal1可恢复；整合素β3缺失则内吞持续受损。结论为整合素β3 α2,6-唾液酸化是HCMV高效内吞而非附着所必需。

Reduced Integrin β3 α2,6-sialylation resulted in a decrease in HCMV infection

研究人员在72 hpi观察CPE，并用IE蛋白、病毒DNA qPCR和TCID₅₀评估感染强度。ST6Gal1敲低组CPE轻，IE蛋白和病毒DNA拷贝降低，3、5、7 dpi子代病毒滴度显著低于野生型与回补组。结论为整合素β3 α2,6-唾液酸化缺陷会削弱HCMV整体感染与复制。

Reduced Integrin β3 α2,6-sialylation decreases the interaction between Integrin β3 and HCMV gH

研究人员用改良ELISA检测重组整合素β3与gH结合，并用神经氨酸酶去除唾液酸，再以co-IP验证细胞内复合物。结果显示ST6Gal1敲低或神经氨酸酶处理均降低整合素β3与gH结合，co-IP中ST6Gal1敲低组整合素β3-gH相互作用减弱。结论为α2,6-SA通过增强整合素β3与病毒配体gH相互作用促进进入。

Integrin β3 α2,6-sialylation mediates HCMV entry signaling

研究人员在感染15 min收样，用Western blot、RhoA活化检测和F-actin成像分析信号与细胞骨架。ST6Gal1敲低抑制整合素β3、Src、Paxillin磷酸化，GTP-RhoA升高、Cofilin磷酸化偏高，应力纤维未解聚，pp28滞留表面；对照和回补组则出现应力纤维解体、pp28核周定位。结论为α2,6-唾液酸化缺失使Integrin-Src与RhoA-cofilin通路活化受损，细胞骨架重排失败，病毒内吞受阻。

讨论与结论翻译

讨论指出，整合素β3糖肽分析显示含末端SA的A2S1G1为最主要糖形，N125和S85靠近β I-like结构域，可能影响配体结合构象；其他疱疹病毒也利用宿主糖基化进入细胞，说明受体糖基化是疱疹病毒常见机制。α2,6-SA缺失后ST3Gal介导的α2,3-唾液酸化补偿不足以恢复进入，提示HCMV偏好α2,6-SA。研究局限包括仅用Towne株和成纤维细胞、不能位点特异地删加N125末端α2,6-SA、未系统研究内皮/巨噬细胞其他受体糖基化。

研究结论：整合素β3由ST6Gal1催化的α2,6-唾液酸化促进HCMV在成纤维细胞内吞；该修饰增强整合素β3与gH结合，激活Integrin β3-Src和RhoA-cofilin通路，驱动肌动蛋白应力纤维重排与病毒进入；ST6Gal1与整合素β3 α2,6-唾液酸化是可用于HCMV早期干预的糖生物学靶点。