不对称PCR（aPCR）联合PAM非依赖型Cas12a对单链扩增子的分析用于现场核酸检测

《Biosensors》：Combining Asymmetric PCR with PAM-Independent Cas12a Analysis of Single-Stranded Amplicons for On-Site Nucleic Acid Testing

　　

一种依赖不对称PCR（aPCR）及Cas12a/guide RNA（gRNA）复合物对单链DNA（ssDNA）扩增子进行PAM非依赖型识别的生物传感系统，被改造用于现场核酸检测（NAT）。aPCR在一台低成本、便携、由智能手机控制的终点模式热循环仪上进行。随后，利用基于Cas12a的检测实现aPCR结果的选择性视觉读取。该aPCR/Cas12a生物传感系统中引入了在扩增产物中掺入尿嘧啶的机制，以防范假阳性。研究人员以有害植物病原细菌Pectobacterium属及该属通用引物Y1和Y2为模型。无PAM要求使得研究人员可通过将gRNA间隔序列（spacer）恰当定位于ssDNA上，针对特定Pectobacterium polaris菌株微调Cas12a检测的选择性。P. polaris检出限达每反应10个细菌基因组拷贝，总检测时间约2 h，支持仪器读数与视觉读数。对人工污染Pectobacterium属的马铃薯样本，该系统对P. polaris菌株表现出相似选择性与灵敏度。结果表明，基于aPCR/Cas12a的生物传感可作为现场NAT适用技术。

研究背景方面，近年来将CRISPR/Cas核酸酶与核酸扩增结合用于现场核酸检测成为趋势。Cas12常配等温扩增，也与终点PCR联用做扩增后选择性分析。但双链DNA（dsDNA）扩增子被Cas12a识别需要原间隔序列邻近基序（PAM），这限制引物与gRNA设计。工程化Cas12a变体或引物引入PAM仍不够灵活。另一思路是转向ssDNA靶标：Cas12a/gRNA可借spacer与ssDNA原型间隔序列杂交而无需PAM。常规PCR与重组酶聚合酶扩增（RPA）本产dsDNA，需用不对称扩增才产ssDNA。现场场景还要求非仪器视觉读出、防扩增产物的气溶胶交叉污染。Pectobacterium polaris是2017年新分类的马铃薯病原菌，既有PCR检测限偏高且需电泳，不适合现场。因此研究人员开展本研究，把aPCR与PAM非依赖Cas12a分析适配到现场NAT：用便携热循环仪、视觉读出、dUTP掺入防假阳性，并以Y1/Y2通用引物产435 bp扩增子。

主要关键技术方法方面，研究人员以Pectobacterium属9株8种、Dickeya 2株2种、Clavibacter 7株6种、Agrobacterium 1株1种、Escherichia 1株1种为细菌样本队列，以非污染或人工污染Pectobacterium属的马铃薯样本为植物基质；用对称PCR建参考、再把引物摩尔比Y1/Y2调为4将常规PCR转为aPCR；用Francisella tularensis Cas12a加gRNA识别ssDNA扩增子，以末端标记FAM与BHQ-1的分子报告探针（MR）读trans切割；用dUTP掺入扩增子并经尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）体系防携带污染；以荧光动力学测初始速率V₀，并以蓝光灯加橙滤片做视觉黄变判读。

研究结果如下。3.1 常规PCR中Y1–Y2引物性能：研究人员用对称PCR发现Y1/Y2可扩Pectobacterium属，但无模板对照晚期出现约60 bp引物二聚体，特异产物熔解温度T_m约87 °C、非特异约81 °C；10拷贝及以上为特异产物，常规PCR检出限取10个基因组/管。3.2 含Y1–Y2的aPCR及Cas12a/gRNA对ssDNA扩增子检测：研究人员缩短循环为15–15–30，比较Y1/Y2摩尔比，发现Y1过量促ssDNA生成，Y1/Y2=4在ssDNA得率与周期数间较优；热变性后即便等摩尔也可激活Cas12a，但Y2过量不产靶标ssDNA。3.3 aPCR/Cas12a检测灵敏度：优化aPCR在纯菌DNA或加100 ng马铃薯DNA时C_q对数线性重合，32次10拷贝运行均明确激活Cas12a，系统检出限为10个P. polaris基因组/反应。3.4 对Pectobacterium属选择性：gRNA1把全部Pectobacterium株判为属阳性；高量非Pectobacterium株虽有扩增曲线，但Cas12a/gRNA1响应与无模板对照无异，故不误认。3.5 用aPCR/Cas12a从Pectobacterium属中鉴别P. polaris：研究人员设计gRNA2/3/4打靶27 nt变异区，gRNA3借错配位置使其他种仅余极弱或无误切割，P. polaris的V₀显著更高（p<0.0001）；人工污染马铃薯结果与商品实时PCR一致。3.6 Cas12a/gRNA识别含尿嘧啶ssDNA扩增子：50% dTTP换dUTP使C_q推迟4–5循环，ssDNA仍激活Cas12a；镁离子升至18 mM可把切割速率恢复到6 mM未修饰水平；加大aPCR加样量不因靶标增多而提速，反受缓冲组分抑制。3.7 视觉检测模式：含尿嘧啶aPCR产物加Cas12a/gRNA3后，蓝光照30 min出现黄变、无模板对照60 min不变；gRNA3可肉眼区分P. polaris与其他Pectobacterium种；加200 ng马铃薯DNA或污染薯样中仍可在10拷贝水平视觉检出。

讨论部分总结：现场NAT多靠等温扩增，但PCR引物库庞大；aPCR产ssDNA绕开PAM，比热变性露ssDNA更可控。等摩尔PCR热处理后虽可偶发单链化，但重退火随长度序列波动大。Cas12a不耐高温故不能一锅法，转移产物致气溶胶污染，dUTP/UDG可降解既往含尿嘧啶扩增产物的携带污染。aPCR的ssDNA得率只需够激活Cas12a即可，不必极致优化。PAM非依赖下gRNA spacer位点的错配数、位置与spacer序列共同决定trans切割，选位需经验试错。本系统对P. polaris株B-3420达10拷贝，比已有终点PCR和实时PCR分别灵敏20倍与2000倍，总时长约2 h；已知NCBI中数株P. polaris靶区一致，但更多菌株仍需验证。视觉读出下gRNA3使阳阴颜色差明确，利于非专业人员现场判读。

结论部分翻译：本研究证明aPCR/Cas12a生物传感可在不牺牲灵敏度与选择性的前提下适配现场核酸检测。aPCR可在低成本便携热循环仪以终点模式运行，产足量大分子单链扩增子以有效激活Cas12a；尿嘧啶掺入经UDG处理可防扩增产物的携带污染，这对无高级分区、无资深人员的现场尤其重要。即便Y1–Y2扩增子长达435 nt，总检测约2 h。以Pectobacterium属尤其P. polaris为模型，系统对P. polaris检出限10基因组/反应、超现有方法至少20倍；无PAM要求可通过spacer定位微调选择性。更广泛地，众多现成PCR检测只需调引物摩尔比转aPCR、再用Cas12a/gRNA看MR切割，便可借便携热循环仪转成现场aPCR/Cas12a检测。论文发表于《Biosensors》。