基于UHPLC-MS/MS鉴定的多代谢物组合建立代谢物风险评分的高血压分子诊断方法

《International Journal of Molecular Sciences》：A Molecular Diagnostic Approach for Hypertension Through Establishment of a Metabolite Risk Score Using a Multi-Metabolite Panel Identified via UHPLC-MS/MS

　　

高血压（Hypertension, HTN）通常无症状，除非血压（Blood Pressure, BP）显著升高，否则难以通过血压测量进行检测。鉴于其与代谢改变和并发症的关联，本研究旨在建立代谢物风险评分（Metabolite Risk Score, MRS），作为补充基于血压诊断的分子工具。通过韩国生物样本库网络（Korea Biobank Network）获取健康个体和HTN患者的血浆样本及临床数据，并进行非靶向代谢组学分析。通过最小绝对收缩和选择算子（Least Absolute Shrinkage and Selection Operator, LASSO）回归筛选出8个与HTN相关的关键代谢物。MRS在发现集中以其加权和计算，并在复制集中得到验证。MRS在复制集中对HTN状态表现出较强的判别能力[曲线下面积（Area Under the Curve, AUC）= 0.926，95%置信区间（Confidence Interval, CI）：0.876–0.976]，且在调整年龄和体质指数（Body Mass Index, BMI）后仍与现患HTN显著相关[优势比（Odds Ratio, OR）= 1.747，95% CI：1.317–2.318，p < 0.001]。在MRS截断值下，复制集的分类准确率约为84%，敏感性为83.7%，特异性为84%。MRS在发现集（r = 0.320，p = 0.001）和复制集（r = 0.335，p < 0.001）中均与收缩压（Systolic Blood Pressure, SBP）呈弱至中度正相关；然而，在调整年龄和BMI后，这些相关性不再具有统计学显著性。这些发现支持进一步评估MRS作为HTN鉴别的补充性分子方法。与其他组学平台的整合可能有助于开发更全面的HTN分子方法。在其潜在的临床应用之前，需要在更大的前瞻性纵向队列中进行进一步验证。

**研究背景**

高血压（Hypertension, HTN）是全球重大公共卫生挑战，在成人中患病率较高。截至2022年，韩国约30%的成人（近1300万人）估计患有HTN。HTN是影响心血管和肾脏功能的主要危险因素，可导致严重并发症，因此准确、早期诊断至关重要。然而，当前HTN诊断标准主要基于血压（Blood Pressure, BP）测量，BP测量虽提供直接且临床必需的信息，但无法表征HTN伴随的分子和代谢改变。HTN常起病隐匿，缺乏明显症状，且伴随氧化应激、慢性低度炎症、内皮功能障碍、神经激素失调及脂质和能量代谢紊乱等相互关联的病理生理改变，这些改变可影响细胞能量利用、线粒体功能以及脂质和氨基酸代谢，从而改变多种分子的循环水平。既往代谢组学研究已报道HTN相关氨基酸、脂质、酰基肉碱等代谢中间体的改变，为利用循环代谢组学特征表征HTN分子表型提供了生物学基础。然而，以往研究多聚焦于发现单一统计学显著代谢物，鉴于HTN等多因素复杂表型，单一生物标志物难以完全捕捉潜在的生物学异质性。基因组学领域已广泛应用遗传风险评分和多基因风险评分整合多个风险变异，受此启发，本研究旨在通过整合多个代谢物信号建立代谢物风险评分（Metabolite Risk Score, MRS），以提供补充常规BP测量的分子信息。

**研究概述**

研究人员通过韩国生物样本库网络（Korea Biobank Network, KBN）获取100名健康个体和100例HTN患者的空腹血浆样本及临床数据，随机等分为发现集和复制集。通过非靶向代谢组学分析，采用最小绝对收缩和选择算子（Least Absolute Shrinkage and Selection Operator, LASSO）回归筛选出8个HTN相关关键代谢物，构建MRS并在复制集中验证。结果显示MRS在复制集中对HTN具有较高的判别性能（AUC = 0.926），且调整年龄和体质指数（Body Mass Index, BMI）后仍与HTN显著相关，提示MRS可作为BP诊断的补充分子工具。该研究发表于《International Journal of Molecular Sciences》。

**主要技术方法**

研究人员采用的关键技术方法包括：（1）非靶向代谢组学分析：利用超高效液相色谱-串联质谱法（Ultra-High-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry, UHPLC-MS/MS）在电喷雾电离（Electrospray Ionization, ESI）正、负离子模式下对血浆样本进行代谢物谱分析，采用Compound Discoverer软件进行推定代谢物鉴定；（2）多变量统计分析：包括主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）、正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal Partial Least Squares-Discriminant Analysis, OPLS-DA）及变量投影重要性（Variable Importance in Projection, VIP）分析；（3）LASSO回归筛选关键代谢物并构建加权MRS（表示为∑β_iM_i，其中β_i为LASSO系数，M_i为对应z分数）；（4）受试者工作特征（Receiver-Operating Characteristic, ROC）曲线评估判别性能，Logistic回归及偏相关分析评估关联。样本来源于KBN下属的Ajou大学医院生物样本库和韩国忠北国立大学医院生物样本库。

**研究结果**

**2.1 发现集健康组与HTN组的临床和生化特征**

发现集共纳入200名韩国受试者（100名健康、100例HTN），随机等分为发现集和复制集，每组各含50名健康者和50例HTN患者。HTN组年龄显著较大、BMI较高，故将年龄和BMI作为混杂因素进行调整。HTN组的SBP、舒张压（Diastolic Blood Pressure, DBP）、血糖、天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate Aminotransferase, AST）和丙氨酸氨基转移酶（Alanine Aminotransferase, ALT）水平在调整前后均显著高于健康组；低密度脂蛋白胆固醇和γ-谷氨酰转肽酶水平在调整混杂因素后显著升高。

**2.2 发现集组间显著差异的代谢物特征**

初始特征检测和质量过滤后，ESI正、负离子模式分别获得306和214个特征。排除未知特征及库支持不足的注释后，正、负模式分别保留23和30个推定注释代谢物。无监督PCA显示前两个主成分分别解释正离子模式61.3%和负离子模式52.5%的总方差，HTN样本分布较健康样本更分散。监督OPLS-DA显示两组代谢物谱显著分离（正离子模式R²Y = 0.896，Q²Y = 0.868；负离子模式R²Y = 0.695，Q²Y = 0.611），100次置换检验的负Q²Y截距表明模型无明显过拟合。

**2.3 高血压的多代谢物组合**

VIP分析在正、负离子模式下各鉴定出9个VIP ≥ 1的代谢物，共18个主要代谢物，其FDR调整p值均小于0.05。对上述主要代谢物进行LASSO回归分析，最终确定8个代谢物组合，包括2-甲基丁酰肉碱、苯乙酰谷氨酰胺、1-苯基-1,3-十八碳二酮、4-苯酚磺酸、色氨酸、脱氧胆酸、神经酸和对甲酚硫酸盐，LASSO系数作为MRS计算的权重。

**2.4 MRS对高血压的判别性能改善及其与常规BP测量的相关性**

发现集中MRS区分HTN与健康个体的AUC为1.00，而SBP和DBP的AUC分别为0.733和0.693。复制集中MRS的AUC为0.926，显著高于SBP（0.820）和DBP（0.636）；含MRS、年龄和BMI的模型AUC为0.954，且Logistic回归显示调整年龄和BMI后MRS仍与HTN显著相关。排除无合并症病史HTN患者的敏感性分析中，MRS仍保持高判别性能（AUC = 0.960）。相关分析显示，发现集中MRS与SBP（r = 0.320）和DBP（r = 0.270）均显著正相关；复制集中仅与SBP显著相关（r = 0.335）；调整年龄和BMI后，复制集中MRS与BP的相关性不再显著。

**2.5 复制集中基于MRS截断值的重分组与原始诊断类别的一致性**

研究人员通过Youden指数从发现集确定MRS截断值为-0.431，将该截断值不变地应用于复制集后，49例HTN患者中41例被正确重新分类为HTN组（准确率83.7%），50名健康个体中42名被正确重新分类为健康组（准确率84.0%），总体分类性能合理。

**2.6 总体研究人群中MRS升高与血脂异常病史的一致且显著关联**

发现集中，有糖尿病、血脂异常和心血管疾病病史的个体MRS分别显著升高3.22、5.67和4.80；复制集中，血脂异常史仍与MRS升高4.95显著相关（p < 0.001），而糖尿病和心血管疾病史的关联不再显著。血脂异常是唯一在两个数据集中均与MRS升高显著相关的合并症。

**讨论与结论**

讨论部分指出，HTN组内代谢组学谱分布