《International Journal of Molecular Sciences》：Phosphoproteomic Data Integration Reveals Paralog-Specific Co-Regulatory Networks of Rho-Associated Kinases ROCK1 and ROCK2
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Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶1和2（ROCK1和ROCK2）是AGC家族中的丝氨酸/苏氨酸激酶，调控细胞骨架动力学、细胞形态和机械信号传导。尽管它们的主要细胞功能已被充分阐明，但其磷酸调控机制在系统水平上仍未得到充分表征。在本研究中，研究人员对3825个人类细胞
Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶1和2（ROCK1和ROCK2）是AGC家族中的丝氨酸/苏氨酸激酶，调控细胞骨架动力学、细胞形态和机械信号传导。尽管它们的主要细胞功能已被充分阐明，但其磷酸调控机制在系统水平上仍未得到充分表征。在本研究中，研究人员对3825个人类细胞系磷酸化蛋白质组数据集进行分析，鉴定了ROCK1和ROCK2中的I类磷酸化位点（定位概率≥75%或A-score>13）。主要磷酸化位点根据其在不同数据集中的检测频率进行排序。利用费舍尔精确检验结合多标准过滤评估了与其他蛋白磷酸化位点（PsOPs）的共调控关系。从ROCK1的607个谱分析和153个差异数据集以及ROCK2的667个谱分析和143个差异数据集中，研究人员将S1105和S1341（ROCK1）以及S1137和S1374（ROCK2）确定为主要磷酸化位点，这些位点均位于激酶结构域之外。ROCK1_S1105与141个PsOPs呈显著正共调控，这些PsOPs的注释功能包括细胞骨架组织、心肌细胞存活、代谢和基因组稳定性，表明潜在的功能协调性。ROCK1_S1341也显示出类似的关联。相比之下，ROCK2_S1374与一个更广泛的包含1349个PsOPs的网络相关联，这些PsOPs参与细胞骨架重塑、细胞周期进程、肥大和纤维化。功能分析揭示了共享的和旁系同源特异性的调控网络，其中C末端磷酸化位点作为潜在枢纽，与细胞骨架调控以及MAPK、PI3K/AKT/mTOR和Wnt信号通路相关。尽管主要位点具有位置保守性，但ROCK2展现出比ROCK1显著更大的其他蛋白磷酸化位点共调控网络，这表明存在旁系同源特异性的调控差异。这为在病理背景下优先选择ROCK磷酸化位点和共调控蛋白作为实验验证候选物以及治疗靶点发现提供了一个假设生成的资源。
论文解读：磷酸化蛋白质组学揭示ROCK1与ROCK2的旁系同源特异性共调控网络
一、研究背景与科学问题
Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶1和2（ROCK1和ROCK2）是AGC家族中的丝氨酸/苏氨酸激酶，作为小GTP酶RhoA的关键效应器，调控细胞骨架动力学、细胞形态和机械信号传导。尽管两者在激酶结构域内具有高达92%的序列同一性，整体氨基酸序列一致性为65%，但它们由不同基因编码，属于旁系同源蛋白，且表现出非冗余的组织分布和细胞功能。ROCK2富集于脑和心肌，而ROCK1广泛表达于肺、肝、脾、肾和睾丸。目前，虽然ROCK1和ROCK2作为激酶磷酸化底物如肌球蛋白轻链（MLC）、LIMK和MYPT1等以调节肌动球蛋白收缩性和细胞骨架张力的功能已被广泛表征，但在全局磷酸化蛋白质组学背景下对ROCK1和ROCK2自身磷酸化的系统性分析仍然有限。理解不同人类细胞环境中ROCK1和ROCK2磷酸化位点的发生频率及其调控模式，对于阐释旁系同源特异性信号传导以及识别可响应治疗干预的调控节点至关重要。此前尚无研究提供这两种激酶的系统级磷酸调控图谱。为此，研究人员开展了此项研究，旨在鉴定在多种人类细胞系背景下最频繁且可重复检测到的ROCK1和ROCK2磷酸化位点，并确定位置保守的磷酸化位点是否与共享的或旁系同源特异性的共调控网络相关联。该论文发表在《International Journal of Molecular Sciences》。
二、主要关键技术方法
研究人员首先汇编了3825个公开的人类细胞系磷酸化蛋白质组数据集，这些数据来源于PubMed检索的同行评审文献，涵盖广泛的生物学和实验条件。数据集分为两类：定性清单式的谱分析数据集和定量比较式的差异数据集。为处理跨研究异质性，研究人员应用了统一的纳入标准：仅限于I类磷酸化位点（定位概率≥75%或A-score>13）；将所有蛋白标识符标准化为HUGO基因命名委员会（HGNC）基因符号；并将单个磷酸化位点注释统一至UniProt规范序列登录号。随后，通过统计每个位点在独立数据集中的检测频率来鉴定主要磷酸化位点。对于每个主要磷酸化位点，研究人员使用费舍尔精确检验（FET）结合四个连续过滤标准（共调控类别检测频率≥10%、FET p值<0.05、至少来自3篇独立出版物、至少3种不同实验条件）来评估与其他蛋白磷酸化位点（PsOPs）的共调控关系。此外，从PhosphoSitePlus、Phospho.ELM和RegPhos 2.0等数据库以及NetworKIN、AKID和iKiP-DB等预测工具中提取了ROCK1和ROCK2的上游激酶、底物和蛋白相互作用伙伴信息，并与共调控结果进行交叉比对。
三、研究结果
3.1 磷酸化蛋白质组数据集汇编：ROCK1和ROCK2磷酸化位点分析与主要磷酸化位点的系统性鉴定
通过对3825个数据集的整合分析，研究人员在谱分析数据集中鉴定到ROCK1的31个不同的I类磷酸化位点，其中19个在至少一种实验条件下被报告为差异调控；ROCK2则鉴定到36个I类位点，其中22个显示差异调控。基于检测频率，ROCK1_S1105和ROCK1_S1341被指定为ROCK1的主要磷酸化位点，ROCK2_S1137和ROCK2_S1374为ROCK2的主要磷酸化位点。
3.2 主要磷酸化位点位于激酶结构域外并展现旁系同源间的位置保守性
所有四个主要磷酸化位点均定位于C末端区域，远离激酶结构域边界，因此ROCK1和ROCK2被归类为主要磷酸化位点位于激酶结构域外的激酶（POKD）。通过EMBOSS NEEDLE算法进行的成对比对显示，ROCK1_S1105与ROCK2_S1137、ROCK1_S1341与ROCK2_S1374分别占据等效的位置，且侧翼序列高度保守。
3.3 ROCK1主要磷酸化位点的共调控磷酸化位点网络
ROCK1_S1105与141个高置信度PsOPs呈正共调控，其注释功能涉及心肌细胞存活信号、线粒体代谢适应、基因组稳定性和细胞骨架稳态。ROCK1_S1341与204个PsOPs正共调控，与288个PsOPs负共调控，其正共调控网络包括BAD_S134、PRKCA_S226和SOS1_S1161等，将其置于非经典Wnt/PCP信号与经典Wnt/β-catenin信号的交汇处。
3.4 ROCK2主要磷酸化位点的共调控磷酸化位点网络
ROCK2_S1137与610个PsOPs正共调控，其网络富含参与内涵体磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信号动态的蛋白。ROCK2_S1374在所有四个主要位点中展现出最广泛的共调控网络，包含1349个正共调控和73个负共调控PsOPs，其网络富含调控细胞骨架重塑、细胞周期进程、肥大基因程序、促纤维化信号和应激反应的蛋白，如MYC_S77、TP53_S315、EGFR_S1064、IRS1_S636以及mTOR复合体组分。
3.5 保守磷酸化位点参与重叠但主要为旁系同源特异性的共调控网络
对两个保守磷酸化位点对的共调控网络进行比较，发现尽管位置保守，但网络组成呈现显著的旁系同源特异性。例如，与ROCK1_S1105和ROCK2_S1137正共调控的PsOPs中，仅有19个蛋白是共享的，而分别有91个和336个是各自独特的。
3.6 与ROCK1和ROCK2主要磷酸化位点共差异调控的上游激酶
整合分析鉴定出15个与ROCK1主要位点共差异调控的上游激酶，以及26个与ROCK2主要位点共差异调控的上游激酶。多个上游激酶家族（如CDK、MAPK和DYRK）在两个旁系同源蛋白间共享。值得注意的是，ROCK2_S1374与RAF1_T303呈负共调控，这与已证实的ERK模块磷酸化形式的RAF1与ROKα（ROCK2）的物理相互作用一致。
3.7 与ROCK1和ROCK2主要磷酸化位点共差异调控的下游底物
共鉴定出104个与ROCK1主要位点共差异调控的下游底物，以及385个与ROCK2主要位点共差异调控的下游底物。ROCK2更广泛的底物网络与其多样的生理和病理功能相符。已验证的底物包括ROCK2在T696位点磷酸化PPP1R12A（MYPT1）以及在S3位点磷酸化CFL1（cofilin）。
3.8 与ROCK1和ROCK2主要磷酸化位点共差异调控的二元相互作用蛋白
从六个蛋白-蛋白相互作用数据库中筛选出ROCK1的33个和ROCK2的66个二元相互作用蛋白。多个相互作用因子（如MYPT1、LIMK1和MYL9）与两个旁系同源蛋白的主要位点均显示共差异调控，表明它们参与共享的效应模块。ROCK2更广泛的相互作用组网络与其在信号密集组织中的更广分布一致。
四、讨论与结论
在讨论部分，研究人员指出本研究的主要发现是ROCK1和ROCK2最常被磷酸化的位点位于C末端区域而非激酶结构域内，这些位点可能作为整合上游信号以微调ROCK活性的节点。尽管这些位点位置保守，但其共调控网络在很大程度上是旁系同源特异性的，这与ROCK1和ROCK2不同的组织表达模式、敲除表型和疾病关联相一致。在上游激酶方面，RAF1与ROCK2_S1374的负共调控关系支持了ERK信号抑制ROCK2驱动细胞骨架收缩性的机制。在致癌信号轴中，ROCK1和ROCK2的磷酸化位点共调控汇聚于RAS/RAF/MAPK、PI3K/AKT/mTOR和Wnt三条主要通路，但具体关联的节点和方向存在差异。ROCK2相较于ROCK1显著更广泛的共调控网络，特别是S1374位点，与ROCK2在心脏肥大、肺纤维化和侵袭性癌症中作为主导旁系同源蛋白的证据一致。研究人员也指出了研究的局限性，包括共调控框架本质上是相关性分析、缺乏蛋白丰度数据校正、使用加工后的补充数据而非原始质谱文件、以及未按生物背景分层分析可能掩盖环境特异性模式等。
研究结论部分翻译如下：本研究对ROCK1和ROCK2进行了全面的磷酸化蛋白质组学分析，鉴定了与主要磷酸化位点相关的旁系同源特异性共调控网络，并提出了关于它们在整合细胞骨架和致癌通路中作用的假设。通过对3825个人类细胞系磷酸化蛋白质组数据集的系统性挖掘，研究人员预测ROCK1和ROCK2上最频繁且可重复磷酸化的位点定位于C末端区域内保守的位置，即激酶结构域之外。这些位点——ROCK1_S1105、ROCK1_S1341、ROCK2_S1137和ROCK2_S1374——基于磷酸化位点共现模式，被预测作为连接细胞骨架信号与致癌MAPK、PI3K/AKT/mTOR和Wnt通路程序的共调控节点。尽管位置保守，ROCK1和ROCK2的共调控网络在很大程度上是旁系同源特异性的，其中ROCK2协调了一个显著更广泛和更多样化的磷酸化位点网络。
